Cepa huésped transformada que se obtiene al llevar a cabo las etapas

(a) clonación de una secuencia genética codón-optimizada que codifica para una fosfatasa alcalina eucariota en un primer vector de expresión con un gen de resistencia a un primer antibiótico,

y en un segundo vector de expresión con un gen de resistencia a un segundo antibiótico; seguido de

(b) transformación de un huésped de levadura con un primer vector de expresión y la selección de transformantes que tienen integrados en el genoma, por lo menos, una copia del primer vector de expresión con una secuencia genética y el gen de resistencia al primer antibiótico, por medio de su crecimiento sobre un medio de cultivo con una baja concentración del primer antibiótico; seguido de

(c) aumento del número de copias de genes del primer vector de expresión mediante transformación múltiple con el primer vector de expresión, en el que la selección se realiza por medio del crecimiento sobre un medio de cultivo con una concentración más elevada del primer antibiótico comparada con la etapa (b); seguido de

(d) transformación de clones transformados del huésped con el máximo rendimiento de expresión en fosfatasa alcalina con el segundo vector de expresión y la selección de transformantes que, además de las copias del primer vector de expresión han incluido las copias del segundo vector de expresión con la secuencia genética y el gen resistente al segundo antibiótico, por medio del crecimiento en un medio de cultivo con el segundo antibiótico; seguido de

(e) aumento del número de copias de los genes del segundo vector de expresión por medio de la transformación múltiple con el segundo vector de expresión, en el que la selección se realiza por medio del crecimiento sobre un medio de cultivo con una concentración más elevada del segundo antibiótico comparada con la etapa (d); seguido de

(f) selección de los clones que tienen integrados de forma estable en el genoma varias copias de la secuencia genética y de los genes de resistencia a los marcadores de selección; y

(g) examinación de los clones obtenidos en la etapa (f) en cuanto a su expresión elevada por medio de una prueba de actividad de la fosfatasa alcalina; siendo el rendimiento de expresión de los clones obtenidos en la etapa (f) aumentado por el factor 4 con respecto a la expresión de los clones obtenidos en la etapa (b) .

Fosfatasa alcalina codón-optimizada y su expresión en levadura La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción recombinada o expresión de la fosfatasa alcalina eucariota. Además, la invención se refiere a un ADN codón-optimizado que codifica para una fosfatasa alcalina eucariota altamente activa con una actividad específica de más de 3000 U/mg. La invención se refiere asimismo a un procedimiento para la inserción de ADN en un vector para su expresión en células de levadura.

Las fosfatasas alcalinas (AP) son fosfomonoesterasas diméricas, no específicas que contienen zinc y que se encuentran tanto en organismos procariotas como en organismos eucariotas, por ejemplo en E. Coli y en mamíferos (McComb y otros, 1979 Alkaline Phosphatases, Plenum Press, Nueva York) . La comparación de la estructura primaria de varias fosfatasas alcalinas evidenció una alto grado de homología (25-30% de homología entre E. Coli y AP de mamíferos; Millàn, 1988 Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris, 1989 Clin. Chim. Acta 186, 133-150) .

En el ser humano y en animales superiores, la familia de AP consiste en cuatro miembros que están codificados en diferentes sitios del gen (Millan, 1988 Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris 1989 Clin. Chim. Acta 186, 133-150) . Pertenecen a la familia de las fosfatasas alcalinas las APs específicas para cada tejido (AP de placenta (PLAP) , AP de células germinales (GCAP) y AP de intestino (IAP) ) y APs no específicas para los tejidos (TnAP) , que están localizadas sobre todo en el hígado, el riñón y los huesos.

Una característica decisiva de las AP conocidas hasta el momento es la gran variabilidad en la actividad catalítica de las AP de mamíferos que poseen un valor kcats 10-100 veces superior al AP de E. Coli. Entre las AP de mamíferos las AP del intestino bovino (bIAP) muestran las actividades específicas más elevadas. Esta característica hace que las bIAP sean atractivas para aplicaciones bioquímicas tales como, por ejemplo, la utilización de los correspondientes conjugados enzimáticos como reactivo diagnóstico o para la desfosforilación de ADN. La existencia de diferentes fosfatasas alcalinas del intestino bovino con actividades específicas de diferentes intensidades se describe en el documento EP 0 955 369 o en Manes y otros (1998) , J. Biol. Chem. 273 No. 36, 23353-23360. Hasta el momento se ha descrito una expresión recombinante de fosfatasas alcalinas, eucariotas, de baja actividad (hasta 3000 U/mg) en diferentes líneas de células eucariotas tales como, por ejemplo, células CHO (bIAP I/WO 93/18139; Weissig y otros, 1993, Biochem J. 260, 503-508) , células COS (AP de placenta humana/Berger y otros, 1987 Biochemistr y 84, 4885-4889) o el sistema de expresión de Baculovirus (AP de placenta humana/Davis y otros, 1992, Biotechnology 10, 1148-1150) también se ha descrito la expresión de APs de mayor actividad (actividad específica > 3000 U/mg) del intestino bovino en células CHO (bIAP II, III y IV/Manes y otros, 1998, J. Biol. Chem. 273 No. 36, 23353-23360) . El inconveniente de la expresión de fosfatasas alcalinas en estos sistemas de expresión es, sin embargo, el bajo rendimiento de expresión que hace que la fabricación recombinante, en especial de una AP altamente activa, no sea económica.

Una expresión de fosfatasas alcalinas eucariotas en huéspedes de expresión procariotas tales como, por ejemplo, E. Coli es ciertamente posible en principio (AP de placenta humana/Beck and Burtscher, 1994 Protein Expression and Purification 5, 192-197) , sin embargo las fosfatasas alcalinas expresadas en procariotas no presentan glicosilación, la cual resulta ser esencial, en especial, para la fabricación de conjugados enzimáticos.

Por lo tanto, la presente invención tiene como objetivo desarrollar un procedimiento de expresión estable y resistente para la fabricación de fosfatasa alcalina eucariota glicosilada con una elevada actividad específica, el cual facilite además, debido a un alto rendimiento de expresión, una fabricación económica de la correspondiente fosfatasa alcalina y, además, proporcione una enzima que es comparable en lo referente a sus propiedades tales como, por ejemplo, la actividad específica y la estabilidad térmica con la fosfatasa alcalina nativa de alta o de baja actividad (disponible en el comercio, por ejemplo en Roche Diagnostics GmbH, Biozyme, Oriental Yeast) .

Un primer objeto de la presente invención es una cepa huésped transformada que se obtiene al llevar a cabo las etapas (a) , la clonación de una secuencia genética codón-optimizada que codifica para una fosfatasa alcalina eucariota en un primer vector de expresión con un gen de resistencia a un primer antibiótico, y en un segundo vector de expresión con un gen de resistencia a un segundo antibiótico; seguido de (b) , la transformación de un huésped de levadura con el primer vector de expresión y la selección de transformantes que tienen integrados en el genoma por lo menos una copia del primer vector de expresión con la secuencia genética y el gen de resistencia al primer antibiótico, por medio de su crecimiento sobre un medio de cultivo con una baja concentración del primer antibiótico; seguido de (c) , el aumento del número de copias de genes del primer vector de expresión mediante transformación múltiple con el primer vector de expresión, en el que la selección se realiza por medio del crecimiento sobre un medio de cultivo con una concentración más elevada del primer antibiótico comparada con la etapa (b) ; seguido de (d) , la transformación de clones transformados del huésped con el máximo rendimiento de expresión en fosfatasa alcalina con el segundo vector de expresión y la selección de transformantes que, además de las copias del primer vector de expresión han incluido las copias del segundo vector de expresión con la secuencia genética y el gen resistente al segundo antibiótico, por medio del crecimiento en un medio de cultivo con el segundo antibiótico; seguido de (e) , el aumento del número de copias de genes del segundo vector de expresión por medio de la transformación múltiple con el segundo vector de expresión, en el que la selección se realiza por medio del

crecimiento sobre un medio de cultivo con una concentración más elevada del segundo antibiótico comparada con la etapa (d) ; seguido de (f) , la selección de los clones que tienen integrados de forma estable en el genoma varias copias de la secuencia genética y de los genes de resistencia a los marcadores de selección; y (g) , la examinación de los clones obtenidos por la etapa (f) en cuanto a expresión elevada por medio de una prueba de actividad de la fosfatasa alcalina; siendo el rendimiento de expresión de los clones obtenidos en la etapa (t) aumentado por el factor 4 con respecto a la expresión de los clones obtenidos en la etapa (b) .

También es objeto de la invención un cultivo líquido en un recipiente de cultivo que contiene un medio de cultivo, metanol y una cepa huésped transformada, según la invención.

También es objeto de la invención una biomasa que contiene una cepa huésped transformada, según la invención.

Asimismo, la presente memoria da a conocer un procedimiento para la obtención de una fosfatasa alcalina eucariota con una elevada actividad específica en levadura, en especial en una levadura metilotrófica, que comprende las siguientes etapas:

a) clonación de una secuencia genética en diferentes vectores, b) transformación de la levadura, c) expresión, y d) purificación de la fosfatasa alcalina, caracterizado porque

(i) un primer vector presenta un gen de resistencia a un primer marcador de selección,

(ii) los transformantes que tienen integrados en el genoma el gen de resistencia y la secuencia genética son seleccionados por su crecimiento sobre un medio de cultivo con una baja concentración del primer marcador de selección,

(iii) el número de copias de genes es aumentado por transformación múltiple, siendo los transformantes múltiples seleccionados por su crecimiento sobre un medio de cultivo con una elevada presión de selección,

(iv) se añade un segundo vector que presenta, además de la secuencia genética, un gen de resistencia a un segundo marcador de selección,

(v) el número de copias de genes es aumentado por transformación múltiple con el segundo vector, siendo los transformantes múltiples seleccionados por su crecimiento sobre un medio de cultivo con una elevada presión de selección, y

(vi) se seleccionan aquellos clones que tienen integrados en el genoma de forma estable varias copias... [Seguir leyendo]

1. Cepa huésped transformada que se obtiene al llevar a cabo las etapas

(a) clonación de una secuencia genética codón-optimizada que codifica para una fosfatasa alcalina eucariota en un primer vector de expresión con un gen de resistencia a un primer antibiótico, y en un segundo vector de expresión con un gen de resistencia a un segundo antibiótico; seguido de

(b) transformación de un huésped de levadura con un primer vector de expresión y la selección de transformantes que tienen integrados en el genoma, por lo menos, una copia del primer vector de expresión con una secuencia genética y el gen de resistencia al primer antibiótico, por medio de su crecimiento sobre un medio de cultivo con una baja concentración del primer antibiótico; seguido de

(c) aumento del número de copias de genes del primer vector de expresión mediante transformación múltiple con el primer vector de expresión, en el que la selección se realiza por medio del crecimiento sobre un medio de cultivo con una concentración más elevada del primer antibiótico comparada con la etapa (b) ; seguido de

(d) transformación de clones transformados del huésped con el máximo rendimiento de expresión en fosfatasa alcalina con el segundo vector de expresión y la selección de transformantes que, además de las copias del primer vector de expresión han incluido las copias del segundo vector de expresión con la secuencia genética y el gen resistente al segundo antibiótico, por medio del crecimiento en un medio de cultivo con el segundo antibiótico; seguido de

(e) aumento del número de copias de los genes del segundo vector de expresión por medio de la transformación múltiple con el segundo vector de expresión, en el que la selección se realiza por medio del crecimiento sobre un medio de cultivo con una concentración más elevada del segundo antibiótico comparada con la etapa (d) ; seguido de

(f) selección de los clones que tienen integrados de forma estable en el genoma varias copias de la secuencia genética y de los genes de resistencia a los marcadores de selección; y

(g) examinación de los clones obtenidos en la etapa (f) en cuanto a su expresión elevada por medio de una prueba de actividad de la fosfatasa alcalina;

siendo el rendimiento de expresión de los clones obtenidos en la etapa (f) aumentado por el factor 4 con respecto a la expresión de los clones obtenidos en la etapa (b) .

2. Cepa huésped transformada, según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia genética codónoptimizada SEQ ID NO: 1, que se ha obtenido a partir del primer y del segundo vectores de expresión, es de mutación silenciosa.

3. Cepa huésped transformada, según la reivindicación 2, caracterizada porque la secuencia genética codónoptimizada que se ha obtenido a partir del primer y del segundo vectores de expresión es SEQ ID NO: 5.

4. Cepa huésped transformada, según la reivindicación 3, caracterizada porque la secuencia genética codónoptimizada es proporcionada por una síntesis "de novo".

5. Cepa huésped transformada, según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el huésped de levadura es Pichia pastoris o Hansenula polymorpha.

6. Cepa huésped transformada, según la reivindicación 5, caracterizada porque el huésped de levadura es la cepa Pichia pastoris X33.

7. Cepa huésped transformada, según una de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizada porque el producto del Bleomycingens de Streptoalloteichus hindustanos es el producto del gen de resistencia al primer vector de expresión.

8. Cepa huésped transformada, según la reivindicación 7, caracterizada porque el primer antibiotico es Zeocin®.

9. Cepa huésped transformada, según una de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizada porque el segundo antibiótico es G418.

10. Cepa huésped transformada, según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la secuencia genética está presente en un casete de expresión en el marco de lectura correcto detrás de la secuencia codificando el péptido señal del factor alfa a partir de Saccharomyces cerevisiae.

11. Cepa huésped transformada, según la reivindicación 10, caracterizada porque el casete de expresión contiene el promotor AOX 1 y la región de terminación de transcripción AOX 1.

12. Cepa huésped transformada, según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la cepa huésped expresa y glicosila fosfatasa alcalina altamente activa.

13. Cultivo líquido en un recipiente de cultivo que contiene un medio de cultivo, metanol y una cepa huésped transformada, según la reivindicación 11.

14. Biomasa que contiene una cepa huésped transformada, según la reivindicación 12.