Diagnóstico de rechazo crónico.

Un método para diagnosticar rechazo crónico (CR) en un individuo trasplantado in vitro que comprende:

a) detectar como el valor de línea base el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen KRT15, originándose dicho gen de una biopsia de tejido de aloinjerto específico de un individuo de control trasplantado del cual se sabe que no desarrolla CR;

b) detectar un nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen identificado en a) en una biopsia de tejido de aloinjerto renal obtenida de un individuo de prueba que recibió un trasplante de riñón en el lapso de 4 a 7 meses después recibido el trasplante; y

c) comparar el valor de línea base con el nivel de expresión de ARNm detectada en la etapa b) en donde el valor de la línea base menor al valor del ensayo en el caso de los genes KRT15 predice que el individuo que recibió el trasplante de riñón tiene un mayor riesgo de desarrollar CR.

Diagnóstico de rechazo crónico Esta invención se relaciona con un método para hacer seguimiento del estado de un tejido u órgano trasplantado en un beneficiario. En particular, la invención se relaciona con el uso de análisis de expresión génica para determinar la predicción temprana de rechazo crónico de un aloinjerto.

El rechazo crónico (CR por sus siglas en inglés) de un aloinjerto es la principal causa para el fracaso de la supervivencia del injerto a largo plazo. En contraste con los episodios tratables de rechazo agudo, el rechazo crónico no puede ser revertido hasta la fecha por ningún tipo de tratamiento cuando es detectado histológicamente, no se ha probado que pueda ser prevenido por medio de algún régimen inmunosupresor y su patogénesis no está completamente entendida pero involucra factores tanto inmunológicos como no inmunológicos. La característica para el rechazo crónico en todos los injertos de órganos sólidos es un engrosamiento concéntrico de la íntima arterial por remodelación vascular. Los aloinjertos de riñón con rechazo crónico exhiben además una fibrosis parenquimal pronunciada y esclerosis glomerular: clínicamente, el Cr se manifiesta por medio de una declinación progresiva en la función renal, acompañada de proteinuria e hipertensión.

Los intentos para identificar biomarcadores en investigación de trasplantes ha sido impulsada principalmente por hipótesis y conduce a la caracterización de genes individuales, polimorfismos, características bioquímicas o histopatológicas. Sin embargo, la mayor parte de estos estudios fueron llevados a cabo sobre muestras de tejido que ya mostraban signos evidentes de enfermedad y por lo tanto únicamente revelaron una asociación con la futura severidad de la enfermedad.

Existe la necesidad de contar con una herramienta confiable para pronóstico temprano y hacer seguimiento de un CR, particularmente el pronóstico temprano de CR antes de cualquier manifestación clínica o histológica, por ejemplo dentro del primer año después de realizado el trasplante; tal ayuda sería invaluable por ejemplo para la optimización de los regímenes actuales de tratamiento y el diseño de ensayos clínicos, que incluyan nuevos agentes que inhiban el CR.

La presente invención se relaciona con la identificación de genes que se expresen en forma diferencial en biopsias de trasplantes, por ejemplo biopsias renales, antes del inicio del CR en pacientes que desarrollarán CR después de tomada la biopsia, y en pacientes que no lo harán. El patrón de expresión génica resultante de un subgrupo de los genes permite una predicción estadísticamente muy significativa de la incidencia del CR. Por ejemplo, los genes identificados en biopsias renales después del trasplante antes de que el CR se haga histológicamente manifiesto, se presentan en las Tablas 1 (genes con mayor actividad) y 2 (genes con menor actividad) y un subgrupo de genes preferidos en la Tabla 3. Las secuencias completas de estos 65 genes divulgados en esta solicitud se encuentran disponibles utilizando el número de acceso el GenBank mostrado en las Tablas 1 a 3.

Los genes identificados de acuerdo con la invención son biomarcadores útiles de predicción para el pronóstico del CR en individuos trasplantados. Cualquier selección, de al menos uno de estos genes, puede ser utilizada como biomarcador sustituto para pronóstico temprano del CR. En realizaciones particularmente útiles, una pluralidad de estos genes, por ejemplo se pueden seleccionar los 10 genes de la Tabla 3 en el caso de biopsias renales, y se puede hacer seguimiento simultáneamente a su expresión del ARNm para proporcionar los perfiles de expresión para uso en diferentes aspectos.

La invención proporciona métodos y usos como se define en las reivindicaciones.

Por lo tanto, la invención proporciona el uso del gen KRT15 y de genes como los enlistados en la Tabla 3, como un biomarcador temprano para el rechazo crónico de un trasplante, por ejemplo como un biomarcador para el CR antes de cualquier manifestación clínica o histológica evidente, por ejemplo dentro del primer año después de realizado el trasplante.

Los métodos de la presente invención deben ser realizados in vitro, por ejemplo, los niveles de biomarcadores deben ser analizados en tejidos o en fluidos extraídos u obtenidos de un individuo trasplantado.

Los métodos para detectar el nivel de expresión del ARNm son bien conocidos en el arte e incluyen, pero no se limitan a, PCR con transcripción inversa, PCR cuantitativa en tiempo real, transferencias tipo Northern y otros métodos de hibridación.

Un método particularmente útil para detectar el nivel de transcritos de ARNm obtenidos a partir de una pluralidad de los genes divulgados involucra la hibridación de ARNm marcado hasta un arreglo ordenado de oligonucleótidos. Tal método permite determinar simultáneamente el nivel de transcripción de una pluralidad de estos genes para generar perfiles o patrones de expresión génica. El perfil de expresión génica derivado de la biopsia obtenida del individuo trasplantado en riesgo de desarrollar CR puede ser comparado con el perfil de expresión génica derivado de la muestra obtenida de un individuo trasplantado que no desarrollará CR.

En una modalidad adicional, la medición de los perfiles de expresión de uno o de una pluralidad de estos genes o proteínas codificadas podría proporcionar herramientas moleculares valiosas para examinar la eficacia de los medicamentos para inhibir, por ejemplo para prevenir o tratar, el CR. Los cambios en el perfil de expresión de un perfil de línea base mientras el paciente trasplantado es sometido a terapia. Por lo tanto, esta invención también proporciona un método para seleccionar un individuo trasplantado para determinar la probabilidad de que el individuo responda a la terapia para el CR, métodos para la identificación de agentes que sean útiles en el tratamiento de un individuo trasplantado que tenga signos de CR y métodos para hacer seguimiento a la eficacia de ciertos tratamientos con fármacos para el CR.

En un aspecto, la invención presenta un método in vitro para identificar al menos un gen que sea expresado en forma diferencial en un aloinjerto de un tipo de tejido dado antes del inicio del CR en un individuo trasplantado de prueba comparado con

i) un perfil de línea base de expresión génica que se origina a partir del mismo tipo de tejido de un individuo trasplantado de control que se sabe que no desarrolla CR; o ii) un perfil de línea base de expresión génica que se origina a partir del individuo trasplantado de prueba en la fecha el trasplante.

El término "expresado diferencialmente" se refiere a un nivel de expresión dado del gen del aloinjerto y se define como una cantidad que es sustancialmente superior o menor a la cantidad del nivel de expresión correspondiente de línea base.

Por lo tanto, el método para diagnosticar rechazo crónico (CR) en un individuo trasplantado in vitro comprende:

a) detectar como el valor de línea base el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen KRT15, originándose dicho gen de una biopsia de tejido de aloinjerto específico de un individuo de control trasplantado del cual se sabe que no desarrolla CR;

b) detectar un nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen identificado en a) en una biopsia de tejido de aloinjerto renal obtenida de un individuo de prueba que recibió un trasplante de riñón en el lapso de 4 a 7 meses después recibido el trasplante; y c) comparar el valor de línea base con el nivel de expresión de ARNm detectada en la etapa b) en donde el valor de la línea base menor al valor del ensayo en el caso de los genes KRT15 predice que el individuo que recibió el trasplante de riñón tiene un mayor riesgo de desarrollar CR.

Además, la invención provee un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

a) detectar como el valor de línea base el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen hoxB7, NPRL2, OS9, y7 para proteína G, OBMCL, DFKZp558B1722, EST ID 32f4, hoxA7 y PRLR, originándose dichos genes a partir de una biopsia de tejido de aloinjerto de un individuo de control trasplantado que se sabe que no desarrolla CR;

b) detectar un nivel de expresión de ARNm correspondiente a los genes identificados en a) en una biopsia de tejido de aloinjerto de riñón obtenida de un individuo de prueba que recibió un trasplante de riñón en el lapso de 4 a 7 meses después... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar rechazo crónico (CR) en un individuo trasplantado in vitro que comprende:

a) detectar como el valor de línea base el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen KRT15, originándose dicho gen de una biopsia de tejido de aloinjerto específico de un individuo de control trasplantado del cual se sabe que no desarrolla CR;

b) detectar un nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen identificado en a) en una biopsia de tejido de aloinjerto renal obtenida de un individuo de prueba que recibió un trasplante de riñón en el lapso de 4 a 7 meses después recibido el trasplante; y c) comparar el valor de línea base con el nivel de expresión de ARNm detectada en la etapa b) en donde el valor de la línea base menor al valor del ensayo en el caso de los genes KRT15 predice que el individuo que recibió el trasplante de riñón tiene un mayor riesgo de desarrollar CR.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

a) detectar como el valor de línea base el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen hoxB7, NPRL2, OS9, y7 para proteína G, OBMCL, DFKZp558B1722, EST ID 32f4, hoxA7 y PRLR, originándose dichos genes a partir de una biopsia de tejido de aloinjerto de un individuo de control trasplantado que se sabe que no desarrolla CR;

b) detectar un nivel de expresión de ARNm correspondiente a los genes identificados en a) en una biopsia de tejido de aloinjerto de riñón obtenida de un individuo de prueba que recibió un trasplante de riñón en el lapso de 4 a 7 meses después de recibido el implante; y c) comparar el valor de línea base con el nivel de expresión de ARNm detectado en la etapa b) en donde el valor de línea base menor al valor del ensayo en el caso de los genes hoxB7, NPRL2, OS9, y7 para proteína G, OBMCL, DFKZp558B1722 y EST ID 32f4 y mayor que el valor del ensayo, predice que el individuo que recibió el trasplante de riñón tiene un mayor riesgo de desarrollar CR.

3. Un método de acurdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la biopsia de tejido de injerto se obtiene del individuo de control el día del trasplante.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, en donde en la etapa b) , el nivel de expresión de ARNm correspondiente al (a los) gen (es) seleccionado (s) en la etapa a) en una biopsia de aloinjerto renal obtenida de un individuo de prueba que recibió un trasplante de riñón, se detecta alrededor de los 6 meses después de recibido el trasplante.

5. Un método para hacer seguimiento al CR in vitro en un individuo trasplantado en riesgo de desarrollar CR que comprende a) obtener una muestra de un individuo que recibió un trasplante de riñón antes de la administración de un agente que inhiba el CR, b) detectar el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen KRT15 en la muestra previa a la administración, c) obtener una o más muestras posteriores a la administración del paciente que recibió el trasplante de riñón, d) detectar el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen KRT15 en la muestra o las muestras de riñón después de la administración, e) comparar el nivel de expresión de ARNm correspondiente al gen KRT15 en la muestra previo a la administración con el nivel de expresión de ARNm de dicho gen en la muestra o las muestras posteriormente a la administración, y f) ajustar el agente en consecuencia.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además:

a) detectar el nivel de expresión de ARNm correspondiente a los genes hoxB7, NPRL2, OS9, y7 para proteína G, OBMCL, DFKZp558B1722, EST ID 32f4, hoxA7 y PRLR, originándose dichos genes a partir de una biopsia de tejido de aloinjerto específico de un individuo de control trasplantado que se sabe que no desarrolla CR;

b) detectar un nivel de expresión de ARNm correspondiente a los genes identificados en a) en una biopsia de tejido de aloinjerto de riñón obtenida de un individuo de prueba que recibió un trasplante de riñón en el lapso de 4 a 7 meses después de recibido el implante; y c) comparar el nivel de la etapa a) con el nivel de expresión de ARNm detectado en la etapa b) en donde el nivel de la etapa a) que es inferior al nivel de la etapa b) en el caso de los genes hoxB7, NPRL2, OS9, y7 para proteína G, OBMCL, DFKZp558B1722 y EST ID 32f4 y mayor que el nivel de la etapa b) en el caso de los genes hoxA7 y PRLR, predice que el individuo que recibió el trasplante de riñón tiene un mayor riesgo de desarrollar CR.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el nivel de expresión de ARNm de uno o más genes se detecta por medio de técnicas seleccionadas de entre el grupo que consiste de análisis de transferencias tipo Northern, PCR de transcripción inversa y PCR cuantitativo en tiempo real.

8. El uso del gen KRT15 como biomarcador para rechazo crónico de trasplante de acuerdo con el método de la 5 reivindicación 1.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además los genes hoxB7, NPRL2, OS9, y7 para proteína G, OBMCL, DFKZp558B1722, EST ID 32f4, hoxA7 y PRLR.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, como un biomarcador para rechazo crónico de trasplante dentro de los 4 a 7 meses después de recibido el trasplante.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 a 10, como un biomarcador para rechazo crónico de trasplante alrededor de los 6 meses.