Una composición farmacéutica que comprende:

(a) una ciclina,

seleccionándose dicha ciclina de entre la ciclina D1, ciclina D2 y ciclina D3,

(b) una quinasa dependiente de ciclina, seleccionándose dicha quinasa dependiente de ciclina de entre CDK4 y CDK6, y

(c) uno o una pluralidad seleccionada del grupo constituido por

(i) un gen que codifica un factor que inhibe la producción, función o acción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho factor es un factor con una acción promotora de la degradación de la proteína de la familia Cip/Kip y es un componente de la ubiquitina ligasa; y

(ii) un ácido nucleico que inhibe la producción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho ácido nucleico es un siARN específico de un gen que codifica la proteína de la familia Cip/Kip;

en el que al menos uno de los genes que codifican dicha ciclina y el gen que codifica dicha quinasa dependiente de ciclina está marcado con una secuencia nucleotídica que codifica una señal de localización nuclear.

Procedimiento de cultivo de células miocárdicas La presente invención se refiere a un procedimiento para proliferar cardiomiocitos de mamífero.

Dado que los cardiomiocitos adultos pierden su capacidad para proliferar mediante división celular, los daños producidos en el corazón por exposición a varias agresiones, tales como isquemia e inflamación, conduce a necrosis o pérdida de cardiomiocitos sin compensación de los mismos. En consecuencia, los cardiomiocitos que sobreviven se hipertrofian de un modo compensatorio para conservar las funciones cardíacas. "El artículo de revisión de Li y Brooks (1999) , European Heart Journal 20:406-420 proporciona una visión general de la maquinaria del ciclo celular y comenta cómo este controla el crecimiento de los cardiomiocitos." No obstante, cuando el estado se mantiene más allá de los límites aceptables para los cardiomiocitos, los cardiomiocitos quedan exhaustos y mueren. En última instancia, dicho estado produce deterioro de las funciones del músculo cardíaco, es decir insuficiencia cardíaca.

Las enfermedades cardíacas, que incluyen principalmente insuficiencia cardíaca, ocupan la segunda posición en las causas de mortalidad en Japón. Adicionalmente, el pronóstico de pacientes con enfermedades cardíacas es tan extremadamente malo que la supervivencia a 5 años es de justo aproximadamente el 50 %. Por tanto, se cree que el desarrollo de un procedimiento terapéutico eficaz de la insuficiencia cardíaca es considerablemente ventajoso desde los puntos de vista del bienestar médico y de la economía médica. Fármacos terapéuticos convencionales para la insuficiencia cardíaca incluyen preparaciones con digitalina que incrementan la fuerza de la contracción del miocardio y preparaciones de xantina y otros estimuladores cardíacos, pero se sabe que la administración a largo plazo de estos fármacos empeora la afección. En los últimos años, las terapéuticas con agentes farmacéuticos 1 para reducir el exceso de cargas en el corazón debido a la elevación del sistema nervioso simpático y el sistema de renina-angiotensina, tales como los 1-bloqueantes y los inhibidores de la ECA, son la corriente dominante. Sin embargo, estos procedimientos terapéuticos son simples tratamientos sintomáticos y nunca pueden recuperar los mismos tejidos cardíacos dañados. Como alternativa, el transplante cardíaco es un procedimiento terapéutico esencial para la insuficiencia cardíaca grave. Debido a problemas como la falta de donantes de órganos, ética médica y cargas corporales y económicas para los pacientes, todavía es muy difícil emplear el transplante cardíaco como procedimiento terapéutico general.

Recientemente se ha estudiado un procedimiento de injerto complementario de cardiomiocitos en el corazón dañado. Se sabe que algunos experimentos que usan animales en los que se injertó en tejido cardíaco adulto cardiomiocitos obtenidos de fetos, los cardiomiocitos pudieron funcionar de forma eficaz como cardiomiocitos (por ejemplo, véase la referencia documento no patente 1) . Se han realizado trabajos de investigación para preparar cardiomiocitos a partir de células pluripotenciales con potencia para diferenciarse en una amplia variedad de células, incluidos cardiomiocitos, es decir las denominadas células madre embrionarias (células ME) para usar como células para injerto. No obstante, estos procedimientos se enfrentarían con muchas dificultades en la aplicación de los mismos a la medicina clínica desde un punto de vista ético. Recientemente se han realizado otros intentos para injertar las células madre derivadas de médula ósea y permitir que las células madre se diferencien en cardiomiocitos en el tejido cardíaco. Sin embargo, la eficiencia de la diferenciación es extremadamente baja. Por tanto, el procedimiento no es tan práctico como un procedimiento para regenerar y compensar cardiomiocitos (véase, por ejemplo, las referencias no patentes 2, 3 y 4, como revisiones) .

Por consiguiente, los presentes inventores de la invención han realizado trabajos de investigación sobre el mecanismo de regulación del ciclo celular de los cardiomiocitos, en particular el papel del sistema de quinasa dependiente de ciclina-ciclina (CDK) . En consecuencia, los inventores han descubierto que, aunque la expresión de la ciclina de tipo D y de la CDK4 se induce mediante la estimulación de, por ejemplo, factores séricos y de crecimiento en los cardiomiocitos, estas moléculas proteicas se localizan en el citoplasma pero no se transfieren al núcleo, por lo que la fosforilación de la proteína RB como molécula diana en el núcleo de la ciclina D-CDK4 o la activación de la ciclina E-CDK2 rara vez se produce. Cuando los inventores prepararon un vector adenovirus en el que se integraron un gen para ciclina D1 marcada con la señal de localización nuclear (NLC) (en lo sucesivo en el presente documento denominada D1NLS) y el gen que codifica CDK4 para permitir que el vector infecte los cardiomiocitos cultivados, la proteína ciclina D1 y la proteína CDK4 se expresaron en el núcleo y produjeron la proliferación y división de los cardiomiocitos a través de la fosforilación de RB. En consecuencia, los inventores consiguieron con éxito la proliferación de cardiomiocitos que rara vez proliferan (se dividen mitóticamente) en las condiciones de cultivo generales. Adicionalmente, los inventores introdujeron el gen de D1NLS y de CDK4 en el tejido muscular cardíaco de un animal adulto para permitir la expresión del mismo, de modo que los inventores progresaron con éxito el ciclo celular de los cardiomiocitos del animal adulto (véase, por ejemplo, la patente de referencia 1, la no patente de referencia 5) . El procedimiento para proliferar cardiomiocitos de acuerdo con la invención se denomina más adelante en el presente documento procedimiento DNLS/CDK.

Se han realizado un gran número de otros intentos para hacer progresar el ciclo celular de los cardiomiocitos para inducir la división de las células (véase, por ejemplo, la referencia no patente 6 como revisión sobre la progresión del ciclo celular de los cardiomiocitos) . Por ejemplo, un informe indica que cuando se expresaron el gen E1A/E1B (véase la referencia no patente 7) o el gen E2F (véase la referencia no patente 8) derivados de adenovirus en cardiomiocitos cultivados aislados de una rata neonata se produjo la inducción de la síntesis de ADN en los cardiomiocitos. En un ratón transgénico en el que se indujo la expresión excesiva del gen de la ciclina D1 del tipo intacto sin ninguna señal de localización nuclear, se observó elevación del nivel de expresión de CDK4 en los cardiomiocitos, junto con la inducción de la síntesis de ADN (véase, por ejemplo, la referencia no patente 9) . Más recientemente se ha indicado que, en un ratón deficiente en el gen jumonji que suprime la expresión del gen de la ciclina D1, se observa que se prolonga la duración de la detención de la proliferación celular en los cardiomiocitos fetales (véase, por ejemplo, la referencia no patente 10) . Como se ha descrito anteriormente, se ha demostrado que la inducción de la síntesis de ADN y la progresión del ciclo celular puede ser posible, incluso en cardiomiocitos. Sin embargo, en los ejemplos experimentales, en los cardiomiocitos se ha observado con frecuencia inducción de apoptosis y aparición de células polinucleares anormales. A excepción del procedimiento DNLS/CDK, no existe ningún procedimiento para estimular la división celular de cardiomiocitos después del nacimiento para incrementar en la práctica el número de células.

Como se ha descrito anteriormente, el procedimiento DNLS/CDK es un procedimiento innovador mediante el cual se puede incrementar los cardiomiocitos que generalmente "rara vez proliferan". Por tanto, el procedimiento es sumamente aplicable en términos industriales.

Se sabe que varios factores de regulación por incremento y por disminución regulan la progresión de los ciclos celulares en células eucariotas generales. Los factores de regulación por incremento incluyen los tipos individuales de ciclina y CDK, mientras que los factores de regulación por disminución incluyen una serie de grupos proteicos denominados inhibidores de CDK. Se han identificado dos familias de inhibidores de CDK que tienen diferentes modos de acción (véase, por ejemplo, la referencia no patente 11, como revisión) . Un primer grupo se denomina proteína de la familia lnk4 e incluye p16 (también conocida como Ink4A, Mts1, Cdkn2 y Cdkn4i) , p15 (también conocida como Ink4B y Mts2) , p18 (también conocida como Ink4C y Ink6A) , y p19 (también conocida como p20, Ink4D y Ink6B) . El primer grupo se une de forma selectiva... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) una ciclina, seleccionándose dicha ciclina de entre la ciclina D1, ciclina D2 y ciclina D3,

(b) una quinasa dependiente de ciclina, seleccionándose dicha quinasa dependiente de ciclina de entre CDK4 y CDK6, y

(c) uno o una pluralidad seleccionada del grupo constituido por

(i) un gen que codifica un factor que inhibe la producción, función o acción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho factor es un factor con una acción promotora de la degradación de la proteína de la familia Cip/Kip y es un componente de la ubiquitina ligasa; y

(ii) un ácido nucleico que inhibe la producción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho ácido nucleico es un siARN específico de un gen que codifica la proteína de la familia Cip/Kip;

en el que al menos uno de los genes que codifican dicha ciclina y el gen que codifica dicha quinasa dependiente de ciclina está marcado con una secuencia nucleotídica que codifica una señal de localización nuclear.

2. Un procedimiento para proliferar cardiomiocitos que comprende una etapa de introducir

(a) una ciclina, seleccionándose dicha ciclina de entre la ciclina D1, ciclina D2 y ciclina D3,

(b) una quinasa dependiente de ciclina, seleccionándose dicha quinasa dependiente de ciclina de entre CDK4 y CDK6, y

(c) uno o una pluralidad seleccionada del grupo constituido por

(i) un gen que codifica un factor que inhibe la producción, función o acción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho factor es un factor con una acción promotora de la degradación de la proteína de la familia Cip/Kip y es un componente de la ubiquitina ligasa; y

(ii) un ácido nucleico que inhibe la producción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho ácido nucleico es un siARN específico de un gen que codifica la proteína de la familia Cip/Kip

en cadiomiocitos in vitro y una etapa de cultivar después dichas células; en el que al menos uno de los genes que codifican dicha ciclina y el gen que codifica dicha quinasa dependiente de ciclina está marcado con una secuencia nucleotídica que codifica una señal de localización nuclear.

3. Uso de

(a) una ciclina, seleccionándose dicha ciclina de entre las ciclina D1, ciclina D2 y ciclina D3,

(b) una quinasa dependiente de ciclina, seleccionándose dicha quinasa dependiente de ciclina de entre CDK4 y CDK6, y

(c) uno o una pluralidad seleccionada del grupo constituido por

(i) un gen que codifica un factor que inhibe la producción, función o acción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho factor es un factor con una acción promotora de la degradación de la proteína de la familia Cip/Kip y es un componente de la ubiquitina ligasa; y

(ii) un ácido nucleico que inhibe la producción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho ácido nucleico es un siARN específico de un gen que codifica la proteína de la familia Cip/Kip, para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar un trastorno cardíaco, en el que al menos uno de los genes que codifican dicha ciclina y el gen que codifica dicha quinasa dependiente de ciclina está marcado con una secuencia de nucleótidos que codifica una señal de localización nuclear.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, el procedimiento de de la reivindicación 2 o el uso de de la reivindicación 3, en el que la proteína de la familia Cip/Kip es p27Kip1.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende introducir los genes en cardiomiocitos usando un vector viral o un liposoma.

6. Un vector que comprende

(a) un gen de ciclina, seleccionándose la ciclina de entre las ciclina D1, ciclina D2 y ciclina D3,

(b) un gen de la quinasa dependiente de ciclina, seleccionándose la quinasa dependiente de ciclina de entre CDK4 y CDK6, y

(c) uno o una pluralidad seleccionada del grupo constituido por

(i) un gen que codifica un factor que inhibe la producción, función o acción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho factor es un factor con una acción promotora de la degradación de la proteína de la familia

Cip/Kip y es un componente de la ubiquitina ligasa; y

(ii) un ácido nucleico que inhibe la producción de la proteína de la familia Cip/Kip, en el que dicho ácido nucleico es un siARN específico de un gen que codifica la proteína de la familia Cip/Kip, en el que al menos uno de los genes que codifican dicha ciclina y el gen que codifica dicha quinasa dependiente de ciclina está marcado con una secuencia de nucleótidos que codifica una señal de localización nuclear.

7. La composición farmacéutica de de la reivindicación 1 o 4, el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 o 5, el uso de de la reivindicación 3 o 4 o el vector de la reivindicación 6, en la que el componente de ubiquitina ligasa es un factor F-box capaz de unirse a la proteína de la familia Cip/Kip.

8. La composición farmacéutica, el procedimiento, el uso o el vector de la reivindicación 7, en la que el factor F-box capaz de unirse a la proteína de la familia Cip/Kip es Skp2.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 4, el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 o 5, el uso de la reivindicación 3 o 4 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el ácido nucleico que inhibe la producción de la proteína de la familia Cip/Kip es un siARN que es específico del gen de

p27Kip1

.

10. Una composición farmacéutica que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.

11. Uso del vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar un trastorno cardíaco.

12. El uso de uno cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 a 9 u 11, en el que el trastorno cardíaco es infarto de miocardio, enfermedad cardíaca isquémica, insuficiencia congestiva cardíaca, miocardiopatía hipertrófica, miocardiopatía dilatada, miocarditis o insuficiencia cardíaca crónica.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción Literatura no patente citada en la descripción