Un procedimiento de uso de CTGF como biomarcador de enfermedad,

eficacia o criterio de valoración sustitutopara una terapia de hipertensión pulmonar que comprende:

i) obtener un nivel basal de CTGF en una muestra biológica de un mamífero enfermo,

ii) medir el nivel de CTGF en una o más muestras biológicas posteriores tomadas del mamífero enfermoque está recibiendo tratamiento para la enfermedad,

iii) comparar el nivel de CTGF en la una o más muestras biológicas posteriores con la muestra basal, y

iv) determinar si se necesitan dosis mayores, tratamientos adicionales o alternativos en base a los nivelesde CRGF obtenidos de una o más muestras biológicas posteriores en comparación con el nivel basal deCTGF,

en el que la muestra es una muestra de tejido cardíaco.

CTGF como biomarcador, diana terapéutica y diagnóstica Campo técnico de la invención La presente invención se encuentra en el campo de la biología molecular, más particularmente la presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico y a secuencias de aminoácidos de un CTGF de rata y su regulación para el tratamiento y uso diagnóstico como biomarcador de enfermedades cardiovasculares y enfermedades hematológicas en mamíferos.

Antecedentes de la invención Tecnología TaqMan / perfil de expresión TaqMan es una técnica desarrollada recientemente en la que la liberación de un colorante indicador fluorescente a partir de una sonda de hibridación en tiempo real durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es proporcional a la acumulación del producto de la PCR. La cuantificación se basa en la parte temprana lineal de la reacción y mediante la determinación del ciclo umbral (CU) , al cual se detecta primero la fluorescencia por encima del fondo.

Las tecnologías de expresión génica pueden ser útiles en varias áreas del descubrimiento y desarrollo de fármacos, tales como la identificación de la diana, la optimización líder y la identificación de mecanismos de acción. La tecnología TaqMan se puede usar para comparar las diferencias entre los perfiles de expresión de tejido normal y de tejido enfermo. El perfil de expresión se ha usado en la identificación de genes, regulados por aumento o por disminución en diversas enfermedades. Una aplicación interesante del perfil de expresión es la monitorización temporal de los cambios en la expresión génica durante la progresión de la enfermedad y el tratamiento farmacológico o en pacientes frente a individuos sanos. La premisa en este enfoque es que los cambios en el patrón de expresión génica en respuesta a estímulos fisiológicos o ambientales (p. ej., fármacos) puede servir como pistas indirectas de los genes causantes de la enfermedad o como dianas del fármaco. Además, los efectos de los fármacos con una eficacia establecida sobre los patrones de la expresión génica global pueden proporcionar una guía, o una firma genérica, frente a la que se puede comparar un nuevo candidato a fármaco.

CTGF

Se puede acceder a la secuencia de nucleótidos del CTGF mediante el número de registro M92934 (ser humano) y AF120275 (rata) . Las secuencias se proporcionan en la SEC ID Nº 1 (ser humano) y la SEC ID Nº 2 (rata) . La secuencia de aminoácidos del CTGF se representa en la SEC ID Nº 3 (ser humano) y la SEC ID Nº 4 (rata) .

El factor de crecimiento del tejido conjuntivo (CTGF) , también conocido como CCN2, es un factor de crecimiento multifuncional de 38 kDa que es miembro de la familia de CCN ([CYR61 (rico en cisteína 61) / CTGF / NOV (sobreexpresado en el nefroblastoma) ] de proteínas secretadas que se caracterizan por ser proteínas matricelulares ricas en cisteína cada una de las cuales contiene cuatro dominios modulares que muestran homología con las proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (dominio 1) , una repetición de tipo C del factor de von Willebran (dominio 2) , una repetición de tipo 1 de la trombospondina (dominio 3) y un dominio en nudo de cisteína (dominio 4) , respectivamente. [Bork y col. (1993) ]. Un dominio en nudo de cisteína contiene sitios de unión a la heparina que median en la unión a los proteoglicanos de heparán sulfato de la superficie celular y de la matriz extracelular [Chen y col., (2001) ]. El CTGF es un gen temprano inmediato inducido potentemente por diversos estímulos que regulan el depósito en la matriz extracelular, la remodelación tisular y la neovascularización, incluidos el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento transformante (TGF) -h, el facto de crecimiento de fibroblastos básico, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la hipoxia en fibroblastos o células endoteliales [Igarashi y col., (1993) ; Grotendorst y col. (1996) ; Shima y col. (2001) ; Suzuma y col., (2000) ]. El CTGF exhibe un diverso abanico de funciones celulares que incluyen la adhesión celular, la estimulación de la migración celular y la potenciación de la síntesis de ADN inducida por factor de crecimiento [Takigawa y col. (2000) ]. El CTGF interacciona con los receptores de la integrina avh3, aIIbh3, a6h1 y amh2 [Chen y col., (2001) ; Gao y col. (2004) ; Jedsadayanmata y col., (1999) ; Schober y col., (2002) ] y se ha comunicado que es un ligando de la proteína 1 relacionada con las lipoproteínas de alta densidad (LRP-1) ; interacciona con LRP-5 para inhibir la señalización Wnt [Gao y col., (2003) ] y puede interaccionar directamente con varios factores de crecimiento que incluyen el TGF-h [Roestenberg y col. (2004) ]. En conjunto, los últimos estudios indican que el mecanismo de acción del CTGF se refiere a su capacidad para modular y amplificar diversos procesos biológicos a través de la unión directa a factores mitogénicos, fibrogénicos y angiogénicos que son importantes en la inflamación y la fibrosis.

El CTGF está publicado (pero no solo) en las patentes WO2004075835 y WO02068579.

Vallon Volker y col. describen formación de CTGF cardíaco dependiente de SGK1 y fibrosis tras tratamiento con DOCA (JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE, vol. 84, nº 5, 2006 páginas 396-404) . Ohnishi Hiromichi y col. describen el incremento de la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en la zona del infarto de infarto de miocardio inducido experimentalmente en ratas (JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CAROIOLOGY, vol. 30, nº 11, 1998, página 2411) . Además, Lee Young-Sam y col. Divulgan que la hipertensión pulmonar inducida con monocrotalina se correlaciona con la regulación por incremento de la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en los pulmones (EXPERIMENTAL & MOLECULAR MEDICINE, vol. 37, nº 1, 2005, página 27) . Rodrigue-Way y col. Describen genes sarcoméricos implicados en el remodelado inverso del corazón durante soporte con dispositivo de ayuda al ventrículo izquierdo (JOURNAL OF HEART ANO LUNG TRANSPLANTATION, MOSBY-YEAR BOOK, INC., ST LOUIS, MO, US, vol. 24, nº 1, 2005, páginas 73-80) . En los documentos WO03/024308, WO2005/070446 y US2005136502 divulgan anticuerpos, cebadores y sondas para detector la proteína o el polinucleótido del CTGF.

Sumario de la invención La invención se refiere al uso de CTGF como biomarcador de enfermedad, eficacia o criterio de valoración sustituto para una terapia de hipertensión pulmonar.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 muestra la secuencia nucleotídica de un polinucleótido de CTGF humano (SEC ID Nº 1) .

Fig. 2 muestra la secuencia nucleotídica de un polinucleótido de CTGF de rata (SEC ID Nº 2) .

Fig. 3 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de CTGF humano (SEC ID Nº 3) .

Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de CTGF de rata (SEC ID Nº 4) .

Fig. 5 muestra la secuencia nucleotídica de un cebador útil para la invención (SEC ID Nº 5) .

Fig. 6 muestra la secuencia nucleotídica de un cebador útil para la invención (SEC ID Nº 6) .

Fig. 7 muestra una secuencia nucleotídica útil como sonda para detectar proteínas de la invención (SEC ID Nº 7) .

Fig. 8 muestra la secuencia nucleotídica de un cebador útil para la invención (SEC ID Nº 8) .

Fig. 9 muestra la secuencia nucleotídica de un cebador útil para la invención (SEC ID Nº 9) .

Fig. 10 muestra una secuencia nucleotídica útil como sonda para detectar proteínas de la invención (SEC ID Nº 10) .

Fig. 11 muestra los resultados de un análisis de expresión en tiempo real de CTGF en corazones de rata (DOCA) .

Eje X: tratamiento; eje Y: expresión relativa; S: control; B: control/placebo; C1: compuesto P/concentración 1; C2: compuesto P/concentración 2; C3: compuesto P / concentración. La expresión de CTGF está regulada por el estado de la enfermedad, el tratamiento y la dosis en el modelo animal.

Fig. 12 muestra los resultados de un análisis de expresión en tiempo real de CTGF en corazones de rata (oclusión) . Eje X: tratamiento; eje Y: expresión relativa; A: control; B: control/placebo; C1: compuesto P/concentración 30 1; C2: compuesto P/concentración 2; C3: compuesto P / concentración. La expresión de CTGF está

regulada por el estado de la enfermedad, el tratamiento y la dosis en el modelo animal.

Fig.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de uso de CTGF como biomarcador de enfermedad, eficacia o criterio de valoración sustituto para una terapia de hipertensión pulmonar que comprende:

i) obtener un nivel basal de CTGF en una muestra biológica de un mamífero enfermo, ii) medir el nivel de CTGF en una o más muestras biológicas posteriores tomadas del mamífero enfermo que está recibiendo tratamiento para la enfermedad, iii) comparar el nivel de CTGF en la una o más muestras biológicas posteriores con la muestra basal, y iv) determinar si se necesitan dosis mayores, tratamientos adicionales o alternativos en base a los niveles de CRGF obtenidos de una o más muestras biológicas posteriores en comparación con el nivel basal de 10 CTGF, en el que la muestra es una muestra de tejido cardíaco.

2. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de CTGF se determina determinando el nivel del polinucleótido de CTGF.

3. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de CTGF se determina determinando el nivel del 15 polipéptido de CTGF.

4. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de CTGF se determina determinando el nivel de actividad de CTGF.

5. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el mamífero es un ser humano.

6. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el uso de CTGF se combina con el uso de uno o más 20 biomarcadores.

7. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el uso de CTGF se combina con el uso de uno o más biomarcadores que están comprendidos en un grupo de biomarcadores que consiste en CRTAC, PRSS23, FN1, LTBP2, TGFB2 y NPR3.

8. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el uso de CTGF se combina con el uso de uno o más

biomarcadores que están comprendidos en un grupo de biomarcadores que consiste en BNP, ANP, Troponina, CRP, Mioglobina, CK-MB o metabolitos.

9. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el uso de CTGF se combina con el uso de uno o más biomarcadores clínicos que están comprendidos en un grupo de biomarcadores que consiste en presión arterial, frecuencia cardíaca, presión arterial pulmonar o resistencia vascular sistémica.

Figuras Fig. 1 SEC ID Nº 1

Fig. 2 SEC ID Nº 2 Fig. 3 SEC ID Nº 3

Fig. 4 SEC ID Nº 4

Fig. 5 SEC ID Nº 5

Fig. 6 SEC ID Nº 6