Composición de adenovirus, que puede obtenerse mediante un método que comprende las siguientes etapas en ese orden:

a) hacer crecer células huésped proporcionando nutrientes a las células huésped mediante perfusión con un medio que contiene glucosa, en el que se regula la tasa de perfusión del medio para controlar la concentración de glucosa desde 1 g/l hasta menos de 2 g/l;

b) infectar dichas células huésped con un adenovirus;

c) recoger y lisar dichas células huésped usando Tween-20 al 1%,

d) clarificar y filtrar el producto de la etapa c),

e) concentrar y diafiltrar la disolución de virus usando una membrana de TFF de 300K de NMWC

f) tratar la disolución de virus de la etapa e) con Benzonase® 100 U/ml durante la noche a temperatura ambiente en presencia de NaCl 1 M,

g) someter la disolución de virus diluida de la etapa f) a cromatografía de intercambio aniónico usando una columna Toyopearl Super Q 650 M, y usando al siguiente sistema de tampón: tampón de carga: Tris 20 mM

+ MgCl2 1 mM + NaCl 0, 3 M, pH≥9, 00, tampón de elución: Tris 20 mM + MgCl2 1 mM + NaCl 2 M, pH≥9, 00

h) concentrar y diafiltrar la disolución de virus de la etapa g) usando una membrana de TFF de 300K de NMWC.

Composiciones de adenovirus que pueden obtenerse mediante un método de producción y purificación mejorado

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a los campos del cultivo celular y la producción de virus. Más particularmente, concierne a métodos mejorados para el cultivo de células de mamífero, la infección de esas células con adenovirus y la producción de partículas de adenovirus infecciosas a partir de las mismas.

2. Descripción de la técnica relacionada

En la actualidad se está evaluando en la práctica clínica vectores adenovirales, que expresan proteínas terapéuticas, para el tratamiento de una variedad de indicaciones del cáncer, incluyendo cánceres de pulmón y cabeza y cuello. A medida que los estudios clínicos progresan, la demanda de vectores adenovirales de calidad clínica está aumentando de manera espectacular. La demanda anual prevista para un estudio clínico de 300 pacientes podría alcanzar, aproximadamente, 6 x 1014 UFP.

Tradicionalmente, los adenovirus se producen en matraces de cultivo tisular comercialmente disponibles o "fábricas de células". Las células infectadas por virus se recogen y se congelan-descongelan para liberar los virus de las células en forma de lisado celular bruto. Entonces se purifica el lisado celular bruto (CCL, "crude cell lys ate") producido mediante ultracentrifugación en gradiente de CsCl doble. El rendimiento del virus normalmente notificado de fábricas de células de 100 bandejas individuales es aproximadamente de 6 x 1012 UFP. Claramente, se hace inviable producir la cantidad requerida de virus usando este proceso tradicional. Han de desarrollarse nuevos procesos de purificación y producción escalables y validables para satisfacer la demanda creciente.

El rendimiento de purificación de la ultracentrifugación en gradiente de CsCl es tan limitado que no puede satisfacer la demanda de vectores adenovirales para aplicaciones de terapia génica. Por tanto, con el fin de conseguir la producción de vector adenoviral a gran escala, han de desarrollarse métodos de purificación distintos de la ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Los informes sobre la purificación cromatográfica de virus son muy limitados, a pesar de la amplia aplicación de la cromatografía para la purificación de proteínas recombinantes. Se ha evaluado la capacidad de la cromatografía de exclusión por tamaño, intercambio iónico y de afinidad para la purificación del retrovirus, virus de la encefalitis trasmitido por garrapata y virus vegetales con niveles de éxito variables (Crooks, et al., 1990; Aboud, et al., 1982; McGrath et al., 1978, Smith y Lee, 1978; O'Neil y Balkovic, 1993) . Se ha realizado incluso menos investigación sobre la purificación cromatográfica de adenovirus. Esta falta de actividad de investigación puede atribuirse parcialmente a la existencia del método eficaz, aunque no escalable, de purificación por ultracentrifugación en gradiente de CsCl para los adenovirus.

Recientemente, Huyghe et al. (1996) y el documento WO96/27677 notificaron la purificación de vector adenoviral usando cromatografía de intercambio iónico junto con cromatografía de afinidad a quelatos metálicos. Se notificó una pureza del virus similar a la de la ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Desafortunadamente, solamente se recuperó el 23% del virus tras el proceso de purificación en columna doble. Los factores de proceso que contribuyen a esta baja recuperación de virus son la etapa de congelación/descongelación utilizada por los autores para lisar las células con el fin de liberar el virus de las células y el procedimiento de purificación de dos columnas.

Claramente, existe una demanda de un método escalable y eficaz de producción de vector adenoviral que recuperará un alto rendimiento del producto para satisfacer la demanda siempre creciente de tales productos.

Sumario de la invención

La presente invención describe un nuevo proceso para la producción y purificación de adenovirus. Este nuevo proceso de producción no sólo ofrece escalabilidad y capacidad de validación sino también una pureza del virus comparable a la conseguida usando ultracentrifugación en gradiente de CsCl.

La presente invención se refiere a una composición de adenovirus que puede obtenerse mediante un método tal como se define en las reivindicaciones Por tanto, la presente invención proporciona una composición de adenovirus que puede obtenerse mediante un método para producir un adenovirus que comprende hacer crecer las células huésped en medios a una tasa de perfusión baja, infectar las células huésped con un adenovirus, recoger y lisar las células huésped para producir un lisado celular bruto, concentrar el lisado celular bruto, cambiar el tampón del lisado celular bruto y reducir la concentración de ácidos nucleicos contaminantes en el lisado celular bruto.

El método comprende además aislar una partícula adenoviral del lisado usando cromatografía. En determinadas

realizaciones, el aislamiento consiste esencialmente en una única etapa de cromatografía. La cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico. La cromatografía de intercambio aniónico utiliza Toyopearl Super Q 650M.

En determinadas realizaciones de la presente invención, la concentración de glucosa en los medios se mantiene entre aproximadamente 0, 7 y aproximadamente 1, 7 g/l. En otras realizaciones determinadas, cambiar el tampón implica una etapa de diafiltración.

En realizaciones preferidas de la presente invención, el adenovirus comprende un vector adenoviral que codifica para un constructo génico exógeno. En determinadas realizaciones de este tipo, el constructo génico está operativamente unido a un promotor. En realizaciones particulares, el promotor es SV40 IE, RSV LTR, 1-actina o CMV IE, tardío principal de adenovirus, F9-1 de polioma o tirosinasa. En realizaciones particulares de la presente invención, el adenovirus es un adenovirus incompetente para la replicación. En otras realizaciones, el adenovirus carece al menos de una parte de la región E1. En determinados aspectos, el adenovirus carece al menos de una parte de la región E1A y/o E1B. En otras realizaciones, las células huésped pueden complementar la replicación. En realizaciones particularmente preferidas, las células huésped son células 293.

En una realización preferida de la presente invención, se contempla que el constructo génico exógeno codifique para un gen terapéutico. Por ejemplo, el gen terapéutico puede codificar para ras antisentido, myc antisentido, raf antisentido, erb antisentido, src antisentido, fms antisentido, jun antisentido, trk antisentido, ret antisentido, gsp antisentido, hst antisentido, bcl antisentido, abl antisentido, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF G-CSF, timidina cinasa o p53.

Las células se lisan y se recogen usando Tween-20® al 1%. El lisado celular se trata con Benzonase®.

El método comprende además una etapa de concentración empleando filtración a través de membrana. La filtración es filtración de flujo tangencial. La filtración utiliza un NMWC de 300K.

La presente invención también da a conocer un método para la purificación de un adenovirus que comprende hacer crecer células huésped, infectar las células huésped con un adenovirus, recoger y lisar las células huésped poniendo en contacto las células con un detergente para producir un lisado celular bruto, concentrar el lisado celular bruto, cambiar el tampón del lisado celular bruto y reducir la concentración de ácidos nucleicos contaminantes en el lisado celular bruto.

El detergente es Tween-20®. El detergente está presente en la disolución de lisis a una concentración de aproximadamente el 1% (p/v) .

Aún en otra realización; la presente invención da a conocer un método para la purificación de un adenovirus que comprende las etapas de hacer crecer células huésped en medios libres de suero; infectar dichas células huésped con un adenovirus; recoger y lisar dichas células huésped para producir un lisado celular bruto; concentrar dicho lisado celular bruto; cambiar el tampón del lisado celular bruto; y reducir la concentración de ácidos nucleicos contaminantes en dicho lisado celular bruto. En realizaciones... [Seguir leyendo]

1. Composición de adenovirus, que puede obtenerse mediante un método que comprende las siguientes etapas en ese orden: a) hacer crecer células huésped proporcionando nutrientes a las células huésped mediante perfusión con un medio que contiene glucosa, en el que se regula la tasa de perfusión del medio para controlar la concentración de glucosa desde 1 g/l hasta menos de 2 g/l;

b) infectar dichas células huésped con un adenovirus;

c) recoger y lisar dichas células huésped usando Tween-20 al 1%, d) clarificar y filtrar el producto de la etapa c) , e) concentrar y diafiltrar la disolución de virus usando una membrana de TFF de 300K de NMWC

f) tratar la disolución de virus de la etapa e) con Benzonase® 100 U/ml durante la noche a temperatura ambiente en presencia de NaCl 1 M, g) someter la disolución de virus diluida de la etapa f) a cromatografía de intercambio aniónico usando una columna Toyopearl Super Q 650 M, y usando al siguiente sistema de tampón: tampón de carga: Tris 20 mM

+ MgCl2 1 mM + NaCl 0, 3 M, pH=9, 00, tampón de elución: Tris 20 mM + MgCl2 1 mM + NaCl 2 M, pH=9, 00

h) concentrar y diafiltrar la disolución de virus de la etapa g) usando una membrana de TFF de 300K de NMWC.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que tras la etapa b) se proporcionan nutrientes a dichas células huésped.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dichos medios están libres de suero.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dichas células huésped pueden crecer en medios libres de suero.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que dichas células huésped se han adaptado para el crecimiento en medios libres de suero mediante una disminución secuencial en el contenido en suero bovino fetal de los medios de cultivo.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dichas células huésped son células

293.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho adenovirus es un adenovirus incompetente para la replicación.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que dichas células huésped pueden completar la replicación.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dichas células se hacen crecer como un cultivo en suspensión celular.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dichas células se hacen crecer como un cultivo dependiente de anclaje.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho adenovirus comprende un vector adenoviral que codifica para un constructo génico exógeno.

12. Composición según la reivindicación 11, en la que dicho constructo génico está operativamente unido a un promotor.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en la que dicho constructo génico exógeno codifica para un gen terapéutico.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la etapa de cromatografía es una etapa de cromatografía única.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la recuperación de adenovirus purificado tras la etapa de cromatografía es del 70% ± el 10% de las UFP de partida.