Composición de bacilos, que comprende de 105 a 1012 UFC/g de células de esporas de bacilos donde lacomposición de bacilos se caracteriza por:

(i): las esporas de bacilos tienen una germinación y crecimiento rápidos desde la espora hasta la célulavegetativa en presencia de un medio de sal biliar que comprende 4 mM de sales biliares y en presencia deun medio de sal biliar que comprende 6 mM de sales biliares, definido por el hecho de que las esporas debacilos alcanzan un punto de crecimiento celular vegetativo de 0,4 DO630 en menos de 18 y 19 horas,respectivamente, donde el punto de crecimiento celular vegetativo es el punto en la curva de crecimientodonde el valor DO comienza a aumentar (debido al crecimiento de las células vegetativas) de formacontinua y alcanza una DO630 de 0,4;

(I): donde el medio de sal biliar es el caldo infusión de carne de ternero (CIT) no selectiva delejemplo 1 suplementado aquí con una mezcla de sal biliar que comprende las sales biliaresconjugadas taurodeoxicholate y glicodeoxicholate y la sal biliar desconjugada deoxicolato en unasproporciones del 60% de taurodeoxicholate, 30% de glicodeoxicholate y 10% de deoxicolato; y

(II): donde se realiza el análisis de ensayo DO por los siguientes pasos:

(a): rellenar un pocillo en una placa de microtitulación con 0,150 ml de medio de sal biliarcon 108 esporas de bacilos por ml de medio (es decir tiempo cero); y

(b): incubar la placa a 37ºC bajo condiciones atmosféricas y medir los valores DO630,utilizando un espectrofotómetro y con agitación antes de cada lectura, para obtener unacurva de crecimiento representativa a lo largo del tiempo;

y

(ii) las células vegetativas de bacilos producen fitasa en una cantidad de al menos 1,25 veces másque la célula de bacilo de referencia DSM 19467, y la cantidad de fitasa producida se mide por elensayo de fitasa del ejemplo 2 aquí, después de 4 horas de crecimiento a 37ºC en el caldo infusiónde corazón no selectiva (CIC) no selectivo del ejemplo 2; y

donde el análisis de ensayo de fitasa se realiza por los siguientes pasos:

(a): hacer durante toda la noche cultivo de células vegetativas de bacilos en un medio decultivo enriquecido; y

(b): transferir un inóculo del 1% del cultivo hecho durante la noche en el medio HIB (esdecir tiempo cero) e incubar a 37ºC hasta la medición de la actividad de fitasa.

Composición de bacilos resistente a la bilis con altos niveles de secreción de fitasa.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una composición de bacilos caracterizada por la rápida germinación y crecimiento en las sales de bilis (entorno intestinal simulado) y por el alto nivel de secreción de fitasa. La composición de bacilos se puede utilizar como suplemento en el pienso de animales donde éste tiene un efecto probiótico (promoción de salud y crecimiento) y mejora la digestión y la disponibilidad de nutrientes de los piensos para animales.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Las bacterias probióticas tales como el Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis se usan en la industria de piensos para animales como complemento de la dieta. Su uso está relacionado con la capacidad de bacilos para reemplazar o reducir el uso de antibióticos, que se usan como promotores de crecimiento en la industria de piensos para animales.

Christian Hansen A/S, Dinamarca comercializa un ejemplo de tal producto de promoción de crecimiento probiótico bajo el nombre comercial GalliPro® (depositado como DSM 17231) . GalliPro® es una composición de esporas de Bacillus subtilis.

Además del modo sugerido de acciones (p. Ej. modulación inmunológica, modificador de flora intestinal) los probióticos bacilos son capaces de producir muchos componentes beneficiosos, tales como enzimas, que se excretan en el tubo gastrointestinal (GI) cuando se usan como suplemento de pienso para animales. Las enzimas como la fitasa se excretan y mejoran la digestión y la absorción del pienso animal (facilitan la digestión) . La dieta (pienso) es principalmente de origen vegetal como granos, maíz, semillas de soja, aceite de soja y aminoácidos. Todos estos efectos contribuyen a la producción de productos para animales rentables. Uno de las muchas enzimas usadas en la industria del pienso para animales es la fitasa. La fitasa se aplica para mejorar la digestión del fósforo en dietas de animales. El fitato es la forma predominante del fósforo en cereales, semillas oleaginosas y leguminosas. No obstante, los animales monogástricos, tales como los cerdos, las aves y los peces, utilizan mal esta fuente de fosfato ya que les falta la enzima de tracto gastrointestinal requerida para liberar el fosfato del compuesto orgánico del fitato. En consecuencia, una gran proporción de fitato en el pienso consumido pasa a través del tracto GI y se excreta en el abono. En entornos de suelo y agua se efectúa la liberación catalizada del fosfato, y el fitato del abono posee un serio problema de contaminación de fósforo contribuyendo a la eutrofización de las aguas de superficie. Además, los productores deben usar un suplemento de fósforo para pienso costoso para satisfacer las necesidades dietéticas de los animales. Además, el fitato tiene propiedades anti-nutritivas que incluyen la formación de compuestos con proteínas y cationes bivalentes, que reducen su biodisponibilidad. Existe documentación sobre el hecho de que la suplementación de fitasa mejora el uso de fosfato en la producción de animales monogástricos, y que tiene un efecto positivo en la biodisponibilidad de los minerales. Las esporas de bacilos pueden pasar la barrera ácidogástrica y germinar y crecer en el tubo gastrointestinal (GI) de los animales. Esto tiene grandes ventajas, ya que cuando se ingieren éstas pueden segregar numerosos tipos de componentes beneficiosos, por ejemplo bacteriocinas y también excretar enzimas útiles tales como la fitasa. Por otra parte, las esporas de bacilos son termoestables durante el proceso de granulación del pienso y son en consecuencia un excelente sistema de entrega para introducir ambas bacteriocinas y enzimas en el GI.

En el proceso de supervivencia y de proliferación de bacilos en el GI, la función de la bilis es importante. La bilis se produce en el hígado y se almacena en la vesícula biliar. La bilis contiene agua, lecitina, bilirrubina y biliverdina y sales de bilis.

Se conoce por la literatura que la bilis tiene algunas influencias negativas en la supervivencia y germinación y segregación de las esporas de bacilos en las células vegetativas en el GI de los animales. Por lo que se sigue investigando para encontrar probióticos de bilis resistentes a las cepas de bacilos.

El artículo (Antoine Van Leeuwenhoek. Agosto 2006; 90 (2) : 139-46. Epub 4 Julio, 2006) describe el aislamiento de un número de muestras/célula de bacilos procedentes directamente del intestino de pollos. Las células aisladas de bacilos fueron probadas para determinar la actividad probiótica. Los seis bacilos de mayor actividad probiótica se probaron para determinar la resistencia a sales biliares y se descubrió que un bacilo específico altamente probiótico tiene un nivel relativamente alto de resistencia a sales biliares. En este artículo no se presta especial atención a cualquier período de tiempo para la prueba de resistencia a bilis. En la parte experimental las células de esporas de bacilos se probaron simplemente para evaluar la resistencia después de 5 días de presencia en sal biliar (ver párrafo “Pequeña prueba de tolerancia en fluido intestinal simulado” en página 141) .

El documento estadounidense 2003/0124104A describe que las endosporas probióticas convencionales de bacilos son sensibles a la baja concentración de sales biliares, es decir que la germinación y/o rehidratación de esporas se inhibe por la presencia de concentraciones incluso bajas de sales biliares. Esto se contradice con otras bacterias tales como patógenos entéricos, tales como E coli o el S. aureus (ver sección [0014] a [0015]) . En vista de esto se sugiere examinar/seleccionar las células de esporas de bacilos que son resistentes a la actividad inhibitoria de las sales biliares, y como resultado, germinan en células vegetativas, para colonizar después el colon (ver [0019]) . Los ejemplos prácticos están todos presentes y no se proveen datos experimentales reales de células específicas de bacilos examinadas realmente en la descripción. Además las condiciones de selección de sales biliares se describen relativa y genéricamente. En particular no se proveen indicaciones de ningún período de tiempo para las selecciones de resistencia a bilis. En otras palabras, en base a la única enseñanza amplia/genérica de este documento, se pueden seleccionar células de bacilos que sólo pueden crecer (germinar) lentamente, es decir que son capaces de germinar de esporas en células vegetativas por ejemplo después de 20 horas en presencia de una cantidad importante de sal biliar.

En este documento no hay descripción o sugerencia para seleccionar células de bacilos que puedan crecer (germinar) rápidamente, es decir capaces de germinar y crecer de esporas en células vegetativas alcanzando un punto de crecimiento definido en un intervalo de tiempo determinado en presencia de una cantidad importante de sal biliar.

En resumen, las referencias a la técnica anterior acerca de la selección/revisión de células de bacilos resistentes a la bilis no se centran en el rápido crecimiento/germinación de células de esporas en células bacilos vegetativas.

La técnica anterior describe varios sistemas de pruebas/selección para la selección de cepas de bacilos que producen enzimas de fitasa. Un ejemplo es el documento estadounidense 6255098 en el que se identifican las cepas de bacilos que producen enzimas de fitasa. No se menciona nada sobre la resistencia biliar de las cepas de bacilos identificadas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

El problema a resolver por la presente invención es proporcionar una composición de bacilos que segregue altas cantidades de fitasa en el tubo gastrointestinal (GI) de un animal.

La solución se basa en que los presentes inventores han desarrollado un método de selección nuevo para la identificación de nuevas composiciones de bacilos mejoradas.

Un nuevo paso importante del nuevo método de selección descrito aquí es específicamente examinar/seleccionar las células de esporas de bacilos con una velocidad mejorada/rápida de germinación y crecimiento a partir de esporas en células vegetativas en presencia de sales biliares.

Como se ha descrito anteriormente, la técnica anterior ha descrito métodos para la selección de células de bacilos capaces de crecer en presencia de sales biliares, pero los métodos de examen/selección de técnica anterior no se centran en la velocidad de germinación... [Seguir leyendo]

1. Composición de bacilos, que comprende de 105 a 1012 UFC/g de células de esporas de bacilos donde la composición de bacilos se caracteriza por:

(i) : las esporas de bacilos tienen una germinación y crecimiento rápidos desde la espora hasta la célula vegetativa en presencia de un medio de sal biliar que comprende 4 mM de sales biliares y en presencia de un medio de sal biliar que comprende 6 mM de sales biliares, definido por el hecho de que las esporas de bacilos alcanzan un punto de crecimiento celular vegetativo de 0, 4 DO630 en menos de 18 y 19 horas, respectivamente, donde el punto de crecimiento celular vegetativo es el punto en la curva de crecimiento donde el valor DO comienza a aumentar (debido al crecimiento de las células vegetativas) de forma continua y alcanza una DO630 de 0, 4;

(I) : donde el medio de sal biliar es el caldo infusión de carne de ternero (CIT) no selectiva del ejemplo 1 suplementado aquí con una mezcla de sal biliar que comprende las sales biliares conjugadas taurodeoxicholate y glicodeoxicholate y la sal biliar desconjugada deoxicolato en unas proporciones del 60% de taurodeoxicholate, 30% de glicodeoxicholate y 10% de deoxicolato; y (II) : donde se realiza el análisis de ensayo DO por los siguientes pasos:

(a) : rellenar un pocillo en una placa de microtitulación con 0, 150 ml de medio de sal biliar con 108 esporas de bacilos por ml de medio (es decir tiempo cero) ; y (b) : incubar la placa a 37ºC bajo condiciones atmosféricas y medir los valores DO630, utilizando un espectrofotómetro y con agitación antes de cada lectura, para obtener una curva de crecimiento representativa a lo largo del tiempo; y

(ii) las células vegetativas de bacilos producen fitasa en una cantidad de al menos 1, 25 veces más que la célula de bacilo de referencia DSM 19467, y la cantidad de fitasa producida se mide por el ensayo de fitasa del ejemplo 2 aquí, después de 4 horas de crecimiento a 37ºC en el caldo infusión de corazón no selectiva (CIC) no selectivo del ejemplo 2; y donde el análisis de ensayo de fitasa se realiza por los siguientes pasos:

(a) : hacer durante toda la noche cultivo de células vegetativas de bacilos en un medio de cultivo enriquecido; y (b) : transferir un inóculo del 1% del cultivo hecho durante la noche en el medio HIB (es decir tiempo cero) e incubar a 37ºC hasta la medición de la actividad de fitasa.

2. Composición de bacilos según la reivindicación 1, donde las células de espora de bacilos de la composición se deshidratan (p. Ej. deshidratadas por pulverización) .

3. Composición de bacilos de las reivindicaciones 1 o 2, donde la célula de bacilo es una célula de B. subtilis.

4. Composición de bacilos de una de las reivindicaciones de 1 a 3, donde las esporas de bacilos alcanzan el crecimiento celular vegetativo al menos 3 horas antes que las células de esporas de Bacillus subtilis de referencia depositadas como DSM 17231 (“ GalliPro® ”) bajo las condiciones del punto (i) de la reivindicación 1.

5. Composición de bacilos según una de las reivindicaciones de 1 a 4, donde las células vegetativas de bacilos producen fitasa en una cantidad de al menos 1, 5 veces más que la célula de bacilo de referencia DSM 19467 bajo las condiciones del punto (ii) de la reivindicación 1.

6. Método para alimentar un animal que comprende la administración de la composición de bacilos de una de las reivindicaciones de 1 a 5 a un animal conjuntamente con otros ingredientes de pienso para animales.

7. Método para alimentar un animal según la reivindicación 6, donde el animal es un animal seleccionado del grupo compuesto por aves, rumiantes, terneros, cerdos, conejos, caballos, peces y animales domésticos.

8. Método para la selección y el aislamiento de una célula de bacilo nueva que comprende los siguientes pasos:

a) : seleccionar y aislar de una agrupación de células de espora de bacilos individuales una nueva célula de espora de bacilo que sea capaz de germinar y crecer tan rápidamente que esta alcanza un punto de crecimiento celular vegetativo en menos de 18 y 19 horas bajo las condiciones del punto (i) de la reivindicación 1; (b) : producir una célula de bacilo vegetativa a partir de la célula de espora aislada del paso (a) y mutar la célula aislada y seleccionada nueva para obtener una agrupación de células vegetativas de bacilos individuales nuevas; (c) : seleccionar y aislar de la agrupación de células vegetativas de bacilos individuales nuevas del paso (b) una nueva célula vegetativa de bacilo que es capaz de producir fitasa en una cantidad de al menos 1, 25 veces más que la célula de bacilo de referencia depositada como DSM número de registro 19467 bajo las condiciones del punto (ii) de la reivindicación 1 y (d) : analizar la célula de bacilo vegetativa de alta producción del paso (c) para confirmar que ésta haya mantenido la germinación y el crecimiento rápida del paso (a) y aislar la célula de bacilo seleccionada.

9. Método para seleccionar y aislar una célula de bacilo nueva de la reivindicación 8, donde la célula de bacilo es un célula de B. subtilis.

10. Célula de bacilo seleccionada del grupo compuesto por:

(a) una célula de Bacillus subtilis con número de registro DSM 19467;

(b) una célula de Bacillus subtilis con número de registro DSM 19489 y

(c) una célula de Bacillus subtilis con número de registro DSM 19466 o una cepa mutante de la misma, donde la cepa mutante se obtiene utilizando una de las cepas depositadas como materia prima y donde la cepa mutante retiene las propiedades esenciales de la cepa depositada, donde, en caso de mutantes de la célula de bacillus subtilis de (a) , dichas propiedades esenciales son:

(i) : la característica de germinación y de crecimiento rápidos del punto (i) de la reivindicación 1 y (ii) : la producción de fitasa en una cantidad al menos al nivel de DSM 19467;

y donde, en caso de mutantes de la célula de Bacillus subtilis de (b) y (c) , dichas propiedades esenciales son:

(i) : la característica de germinación y de crecimiento rápidos del punto (i) de la reivindicación 1 y (ii) : la producción de fitasa en una cantidad del punto (ii) de la reivindicación 1.