COMPLEJOS DE FACTORES DE CRECIMIENTO Y MODULACIÓN DE MIGRACIÓN Y CRECIMIENTO CELULAR.

Complejos de factores de crecimiento y modulación de migración y crecimiento celular Campo de la invención Esta invención se refiere a complejos de proteínas que tienen dominios respectivos que permiten la unión a y la activación tanto del receptor del factor de crecimiento insulínico de tipo 1 como de un receptor integrina para vitronectina. En particular, esta invención se refiere a proteínas quiméricas que comprenden factor de crecimiento insulínico-I y un dominio de unión al receptor integrina de vitronectina. Más en particular, esta invención se refiere a complejos de proteínas que estimulan la migración celular y a composiciones, usos médicos y métodos in vitro que fomentan o inducen la migración y/o proliferación celular. Estas composiciones, usos y métodos pueden tener uso en cicatrización, ingeniería de tejidos, tratamientos cosméticos y terapéuticos tales como reemplazo de piel y regeneración de piel y tratamiento de quemaduras donde se requiere migración y/o proliferación de células epiteliales. Las proteínas quiméricas de la invención también pueden ser útiles para la producción de agonistas y antagonistas de las acciones biológicas de complejos de proteínas que comprenden factores de crecimiento de tipo insulínico, vitronectina y proteínas de unión a factores de crecimiento de tipo insulínico. Antecedentes de la invención Los factores de crecimiento de tipo insulínico (IGF), IGF-I e IGF-II, son factores de crecimiento peptídicos mitogénicos implicados en un amplio espectro de procesos celulares que incluyen hiperplasia, síntesis de ADN, diferenciación, progresión del ciclo celular e inhibición de apoptosis (Keiss et al., 1994, Hormone Research 41 66; Wood & Yee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1; Jones & Clemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3). Estos efectos están mediados a través de la unión a su receptor tirosina quinasa unido a la superficie celular, el receptor de IGF de tipo I (IGF-IR). Los IGF también están estrechamente regulados por una familia de proteínas de unión específica, denominadas IGFBP, cuyo papel principal es unirse a los IGF libres y de esta manera moderar su semivida, especificidad y actividad (Clemmons, 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140 19). Recientemente se ha mostrado que la vitronectina (VN) se une directamente a IGF-II (Upton et al., 1999. Endocrinology 140 2928-31) mientras que IGF-I se puede unir a VN en presencia de ciertas IGFBP, como se describe en la publicación internacional WO 02/24219. El descubrimiento de que VN, una molécula de organización y adhesión de la MEC, se une a IGF-II con una afinidad que es similar a la de IGF-II por IGF-IR (Upton et al., 1999, anteriormente), su receptor biológicamente relevante, revela una unión física específica entre la acción de IGF y VN en la MEC. Además, IGF-II unido a VN puede estimular respuestas funcionales sinérgicas en queratinocitos humanos in vitro (publicación internacional WO 02/24219). VN es una glicoproteína que es muy abundante en la sangre y en la MEC. Sintetizada principalmente en el hígado, pero expresada en muchos otros tipos celulares, VN circula en la sangre en una conformación cerrada y se deposita en la MEC en una conformación abierta o extendida (Schvartz et al., 1999, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology 31 531-44). Se cree que ambas conformaciones se unen a IGF-II (Upton et al., 1999, anteriormente; publicación internacional WO 02/24219; McMurty et al., 1996, Endocrinology 150:149-60) y también se une a otros múltiples ligandos incluyendo colágeno (Morris et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269 23845-52), glicosaminoglicanos (Francois et al., 1999, Journal of Biological Chemistry 274: 37611-19), otras muchas proteínas de la MEC y una amplia variedad de integrinas, particularmente las integrinas v. En efecto, el principal papel de vitronectina es como una molécula de organización de la MEC que proporciona uniones adhesivas a estos receptores integrinas de superficie celular a través de un motivo de unión RGD. Se ha mostrado que los receptores de VN (integrinas v) regulan la reorganización del citoesqueleto de actina requerida para el crecimiento e invasión, por tanto, la unión de VN coordina adhesión y movimiento celular (DePasquale, 1998, Histochemistry and Cell Biology 110: 485-94; Huang, 2000, Oncogene 19 1915-23). Sin embargo, las contribuciones relativas respectivas de los IGF y VN presentes en los complejos de proteínas, en términos de estimular respuestas biológicas tales como migración y/o proliferación celular, ha permanecido elusiva, como lo ha hecho el sitio de interacción proteína-proteína entre los IGF/IGFBP y VN. Compendio de la invención Los presentes inventores han descubierto que complejos de proteínas que comprenden IGF-II y VN o IGF-I e IGFBP y VN estimulan la migración y/o proliferación celular mediante unión y coactivación sinérgica del receptor de IGF-I (IGF-IR) y receptores integrinas que se unen a VN. Además, se ha identificado un dominio polianiónico de VN como un sitio de unión propuesto de cualquiera de los IGF o las IGFBP. Por tanto, en el presente documento se divulgan complejos de proteínas aislados que comprenden un dominio de unión al receptor de un dominio del factor de crecimiento y un dominio de vitronectina o fibronectina que es capaz de 2   unirse a un receptor integrina, en donde el complejo de proteínas aislado puede coactivar el receptor del factor de crecimiento y la integrina para provocar de esta manera una respuesta biológica. Se divulga un complejo de proteínas aislado que comprende: (i) un factor de crecimiento, o al menos un dominio de un factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor afín del factor de crecimiento; y (ii) vitronectina (VN) o fibronectina (FN), o al menos un dominio de unión a integrinas de VN o FN. También se divulga un complejo de proteínas aislado en forma de una proteína quimérica sintética que comprende una secuencia de aminoácidos de: (i) un factor de crecimiento, o al menos un dominio de un factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor afín del factor de crecimiento; y (ii) vitronectina (VN) o fibronectina (FN), o al menos un dominio de unión a integrinas de VN o FN. Preferiblemente, según las divulgaciones anteriormente mencionadas el factor de crecimiento es IGF-I o IGF-II. Más preferiblemente el factor de crecimiento es IGF-I. En divulgaciones donde el factor de crecimiento es IGF-I, de forma adecuada dicho al menos un dominio de IGF-I incluye el residuo 24 de IGF-I. En divulgaciones donde el factor de crecimiento es IGF-II, de forma adecuada dicho al menos un dominio de IGF-II incluye el residuo 27 de IGF-II. En divulgaciones alternativas, el factor de crecimiento es VEGF o PDGF. La presente invención proporciona en un aspecto, una proteína quimérica sintética capaz de fomentar la migración y/o proliferación celular, que comprende una secuencia de aminoácidos de: (i) el factor de crecimiento insulínico de tipo I (IGF-I) que comprende la SEQ ID NO: 3; y (ii) al menos un dominio de unión a integrinas de vitronectina (VN) que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 52 de la vitronectina madura (SEQ ID NO: 2); en donde la proteína quimérica sintética no incluye un dominio de unión a heparina (HBD) de VN que corresponde a los residuos 347-459 de la VN madura (SEQ ID NO: 2) y en donde la proteína quimérica sintética no comprende una secuencia de aminoácidos de IGFBP. Preferiblemente, el receptor integrina es una integrina v. Más preferiblemente, el receptor integrina es una integrina vß3 o una integrina vß5. Este aspecto de la invención también incluye en su ámbito deleciones, adiciones, sustituciones y/o mutaciones de secuencias de aminoácidos que corresponden a los aspectos (i) y (ii) anteriores. En un aspecto adicional, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la proteína quimérica sintética del aspecto anterior. En un aspecto adicional, la invención proporciona una construcción genética que comprende el ácido nucleico aislado del aspecto anterior operativamente unido a una o más secuencias reguladoras en un vector de expresión. Preferiblemente, la construcción genética es una construcción de expresión. En un aspecto más, la invención proporciona una célula huésped que comprende la construcción genética del aspecto anterior. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína sintética del aspecto anterior y un soporte, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Este aspecto de la invención también contempla una composición farmacéutica que comprende la célula huésped del aspecto anterior, célula que expresa dicha(s) proteína(s) sintética(s). También se divulga un anticuerpo específico para la proteína sintética... [Seguir leyendo]

1. Una proteína quimérica sintética capaz de fomentar la migración y/o proliferación celular que comprende una secuencia de aminoácidos de: (i) el factor de crecimiento insulínico de tipo I (IGF-I) que comprende SEQ ID NO: 3; y (ii) al menos un dominio de unión a integrinas de vitronectina (VN) que comprende los residuos de aminoácidos del 1 al 52 de la vitronectina madura (SEQ ID NO: 2); en donde la proteína quimérica sintética no incluye un dominio de unión a heparina (HBD) de VN correspondiente a los residuos 347-459 de VN madura (SEQ ID NO: 2) y en donde la proteína quimérica sintética no comprende una secuencia de aminoácidos de IGFBP. 2. La proteína quimérica sintética de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión a integrinas es un dominio de unión a integrinas integrina vß5. v seleccionado de un dominio de unión a integrina vß3 y un dominio de unión a 3. La proteína quimérica sintética de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho al menos un dominio de unión a integrinas de VN no comprende una secuencia de aminoácidos polianiónica correspondiente a los residuos 53-64 de una proteína VN madura. 4. La proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además al menos una secuencia enlazadora. 5. La proteína quimérica sintética de la reivindicación 4, en donde la secuencia enlazadora comprende un sitio de corte de una proteasa. 6. La proteína quimérica sintética de la reivindicación 4, en donde la secuencia enlazadora se selecciona del grupo que consiste en: (i) Gly4 Ser (SEQ ID NO: 4); (ii) Gly4 Ser3 (SEQ ID NO: 5); (iii) (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 6); (iv) Leu Ile Lys Met Lys Pro (SEQ ID NO: 7); y (v) Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys (SEQ ID NO: 8). 7. La proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende una o más mutaciones en VN. 8. La proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 15. 9. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1- 8. 10. Una construcción genética que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 9 operativamente unido a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en un vector. 11. La construcción genética de la reivindicación 10, que es una construcción de expresión en donde el ácido nucleico aislado está operativamente unido a un promotor. 12. Una célula huésped que comprende la construcción genética de la reivindicación 10 o la reivindicación 11. 13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un soporte, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. 14. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 13 para su uso en cicatrización, reparación de la piel, curación de quemaduras o úlceras o terapia de reemplazo de piel. 15. Un implante quirúrgico, soporte o prótesis impregnada, recubierta o que comprende de otra manera la proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 16. Un vendaje de herida o quemadura que comprende la proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 23   17. Un método in vitro de fomentar la migración y/o proliferación celular que incluye el paso de usar la proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para unirse tanto a un receptor del factor de crecimiento como a un receptor integrina expresados por una célula para de esta manera inducir, aumentar o fomentar de otra manera la migración y/o proliferación de dicha célula. 18. La proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en fomentar la cicatrización, reparación de la piel, curación de quemaduras o úlceras o terapia de reemplazo de piel, en donde la proteína quimérica sintética se une tanto a un receptor del factor de crecimiento como a un receptor integrina expresados por una célula para de esta manera inducir, aumentar o fomentar de otra manera la migración y/o proliferación de dicha célula. 19. La proteína quimérica sintética de la reivindicación 18, en donde dicha proteína quimérica sintética es para administración a un animal para fomentar la migración y/o proliferación celular in situ. 20. La proteína quimérica sintética de la reivindicación 19, en donde dicha proteína quimérica sintética es para uso profiláctico o terapéutico para inducir, aumentar o fomentar de otra manera la migración y/o proliferación de células epiteliales para facilitar de esta manera la cicatrización in situ. 21. La proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde el animal es un ser humano. 22. Uso de la proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para diseñar, identificar o producir una molécula que es un agonista o antagonista de un complejo proteico que comprende un factor de crecimiento y vitronectina. 23. Uso según la reivindicación 22, para producir un agonista de un complejo proteico que comprende IGF-I, una IGFBP y vitronectina, o para producir un antagonista de un complejo proteico que comprende IGF-I, una IGFBP y vitronectina. 24. Uso de la proteína quimérica sintética de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricación de un medicamento para fomentar la cicatrización, reparación de la piel, curación de quemaduras o úlceras o terapia de reemplazo de piel, en donde la proteína quimérica sintética en el medicamento se une tanto a un receptor del factor de crecimiento como a un receptor integrina expresados por una célula para de esta manera inducir, aumentar o fomentar de otra manera la migración y/o proliferación de dicha célula. 24   FIGURA 1   FIGURA 2 26   FIGURA 3 27   FIGURA 4 28   FIGURA 5 29   FIGURA 6   Secuencia de aminoácidos de vitronectina de longitud total (incluyendo péptido señal) Estructura de dominios Residuos Residuos Péptido señal Dominio de somatomedina B Motivo RGD Región polianiónica (ácida) Repeticiones similares a hemopexina (x2) - Dominio central de hélice enrollada de 4 aspas - Dominio C-terminal de unión a heparina Región policatiónica (básica) 31 1-44 45-47 53-64 131-459 131-342 347-459 348-379 1-19 20-63 64-66 72-83 150-478 150-361 366-478 367-398 Sitios de modificación de residuos Residuos Residuos Sitio de fosforilación por la PK dependiente de AMPc Residuos de tirosina sulfatados (x2) Sitio de fosforilación por PKC Sitio de fosforilación por caseína quinasa (x2) 378 56, 59 362 50, 57 397 75, 78 381 69, 76 Sitios de reconocimiento de proteasas Residuos Residuos Sitio de corte endógeno (proteasa sin identificar) Sitio de corte de trombina Sitio de corte de trombina Sitio de corte de elastasa Sitio de corte de elastasa Sitio de corte de plasmina 379-380 305-306 370-371 330-331 383-384 361-362 398-399 324-325 389-390 349-350 402-403 380-381 Sitios de unión a sustratos Residuos Residuos PAI-1 PAI-1 uPAR Integrina Colágeno Colágeno Complejo trombina antitrombina III Plasminógeno Glicosaminoglicano Residuos numerados según su posición en la proteína madura Residuos numerados según su posición en la pro-proteína (con péptido señal) FIGURA 7 12-30 348-370 Región SomB 45-47 Región policatiónica Región polianiónica Región policatiónica 332-348 348-361   FIGURA 8 32   FIGURA 9 33   Porcentaje sobre el control (menos VN) FIGURA 10 34   FIGURA 11   FIGURA 12 36   A) Secuencia de AA de VN B) Secuencia de AA de IGF-I C) Secuencias enlazadoras 1) 2) 3) 4) 5) Gly4 Ser Gly4 Ser3 (Gly4 Ser)3 Leu Ile Lys Met Lys Pro Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys Sitio de reconocimiento de corte por plasmina Ref: FASEB (2001) 15: 1300-2 Sitio de reconocimiento de corte por colagenasa-3 Ref: Biomacromolecules (2003) 4: 1214-23 FIGURA 13 37   FIGURA 14 38   FIGURA 14 (Cont.) 39   FIGURA 14 (Cont.)   FIGURA 14 (Cont.) 41   FIGURA 15 42