Métodos para acoplar péptidos direccionadores a enzimas lisosomales recombinantes para optimizar los tratamientos de las enfermedades por depósito lisosomal.

Un método para preparar un péptido direccionador conjugado con una enzima lisosomal recombinante,

método que comprende lo siguiente:

(a)

i. modificar el término amino (N) y uno o más residuos de lisina en una enzima lisosomal recombinante humana, usando un primer agente entrecruzador para generar una enzima lisosomal recombinante humana modificada por un primer agente entrecruzador;

ii. modificar el primer aminoácido de un enlazador corto en el término amino (N) en un péptido de la variante IGF-2, usando un segundo agente entrecruzador para generar un péptido de la variante IGF-2 modificado por el segundo agente entrecruzador y

iii. conjugar la enzima lisosomal recombinante humana modificada con el primer agente entrecruzador con el péptido de la variante IGF-2 que contiene un enlazador corto modificado por el segundo agente entrecruzador o

(b) conjugar un agente entrecruzador heterobifuncional con un péptido de la variante IGF-2; y conjugar el péptido de la variante IGF-2 modificado por un agente entrecruzador heterobifuncional con una enzima lisosomal recombinante humana, por reacción con el término N y uno o más residuos de lisina en la enzima lisosomal recombinante humana o

(c) conjugar un agente entrecruzador heterobifuncional con una enzima lisosomal recombinante humana por reacción con el término N y uno o más residuos de lisina en la enzima lisosomal recombinante humana; y conjugar la enzima lisosomal recombinante humana modificada por el agente entrecruzador heterobifuncional con un péptido de la variante IGF-2;

donde la enzima lisosomal recombinante humana se selecciona entre α-glucosidasa recombinante humana (rhGAA), δ-galactosidasa A (GLA) recombinante humana, ß-glucuronidasa ácida (GUS) recombinante humana, δ-iduronidasa A (IduA) recombinante humana, isuronidato 2-sulfatasa (I2S) recombinante humana, ß-hexosaminidasa A (HexA) recombinante humana, ß-hexosaminidasa B (HexB) recombinante humana, δ-manosidasa A recombinante humana, ß-glucocerebrosidasa (GlcCerase) recombinante humana, lipasa ácida recombinante humana (LPA) o cualquiera de sus combinaciones y

donde el primer agente entrecruzador se selecciona entre N- succinimidil-6-hidrazinonicotinato acetona (S-Hynic), sulfo-succinimidil-6-hidrazonicotinato acetona (sulfo-S-HyNic), C6-succinimidil-6-hidrazino-nicotinamida (C6-SHynic), clorhidrato de succinimidil-4-hidrazidotereftalato (SHTH) clorhidrato de succinimidil-4-hidrazino nicotinato (SHNH) o N-hidroxisuccinimida-éster-(PEG)n-hidrazida, donde n está representado por 3-24 unidades de PEG; y el segundo agente entrecruzador se selecciona entre PEG4-pentafluorobencen-4-formilbenzoato (PEG4-PFB), succinimidil-4-formilbenzoato (SFB) y C6-succinimidil-4-formilbenzoato (C6-SFB) o

el primer agente entrecruzador se selecciona entre N-hidroxisuccinimida éster fosfina (NHS-fosfina), sulfo-Nhidroxisuccinimida éster-fosfina (sulfo-NHS-fosfina), N- hidroxisuccinimida éster-tetraoxapentadecan-acetileno (NHS35 PEG4-acetileno) o N- hidroxisuccinimida éster-(PEG)n acetileno, donde n representa 3-24 unidades de PEG, entrecruzadores heterobifuncionales escindibles, tales como NHS-PEG3-S-S-acetileno o entrecruzadores heterobifuncionales que contienen ciclooctinas, tales como difluorociclooctina (DIFO) y dibenzociclooctina (DIBO); y el segundo agente entrecruzador se selecciona entre N-hidroxisuccinimida éster-PEG4-azida (HS-PEG4-azida), Nhidroxisucciniminda

éster azida (NHS-azida), N-hidroxisuccinimida éster-(PEG)n azida, donde n representa 3-24 unidades de PEG, o NHS-PEG3-S-S-azida o

el agente entrecruzador heterobifuncional se selecciona entre m-maleimidobenciol-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), sulfo-m-maleimidobenciol-N-hidroxisuccinimida éster (sulfo-MBS) y sulfosuccinimidil-4-(Nmaleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC); y

donde el péptido de la variante IGF-2 comprende uno o más de las siguientes modificaciones con respecto a la secuencia IGF-2 nativa humana:

sustitución de leucina por tirosina en la posición 27;

sustitución de leucina por valina en la posición 43;

sustitución de arginina por lisina en la posición 65;

y/o el péptido de la variante IGF-2 comprende una etiqueta de afinidad y/o una región de extensión enlazadora de al menos 5 aminoácidos que preceden al IGF-2. sustitución de arginina por ácido glutámico en la posición 6;

eliminación de aminoácidos 1-4 y 6;

eliminación de aminoácidos 1-4, 6 y 7;

eliminación de aminoácidos 1-4 y 6 y sustitución de lisina por treonina en la posición 7;

eliminación de aminoácidos 1-4 y sustitución de glicina por ácido glutámico en la posición 6 y

sustitución de lisina por treonina en la posición 7;