Método para producir L-treonina que comprende cultivar una bacteria productora de L-treonina que pertenece a Escherichia coli,

en el que dicha bacteria se ha modificado para potenciar la actividad de aspartato-Dsemialdehído deshidrogenasa aumentando la expresión del gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa, en el que dicha bacteria se ha modificado además para potenciar la expresión del gen thrA mutante que codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I y es resistente a la inhibición por retroalimentación mediante treonina; el gen thrB que codifica para homoserina cinasa; el gen thrC que codifica para treonina sintasa; y el gen rhtA que codifica para una proteína que confiere resistencia a homoserina y treonina, en un medio de cultivo para provocar la acumulación de L-treonina en el medio de cultivo, y recoger la L-treonina del medio de cultivo, en el que las expresiones de los genes se potencian colocando los genes bajo el control de un promotor potente y/o aumentando el número de copias de los genes, en el que dicho promotor bajo el cual se coloca el gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa se selecciona del grupo que consiste en promotor trp, promotor trc, promotor PR y promotor PL, en el que dicho gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

Bacteria productora de l-treonina que pertenece al género escherichia y método para producir L-treonina

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un método para producir una L-treonina mediante fermentación, y más específicamente a un gen derivado de Escherichia coli que ayuda en esta fermentación. El gen es útil para la mejora de la producción de L-treonina.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Convencionalmente, se producen L-aminoácidos a escala industrial mediante métodos de fermentación utilizando cepas de microorganismos obtenidos de fuentes naturales o mutantes de los mismos, que se modifican para potenciar los rendimientos de producción de L-aminoácidos.

Se han notificado muchas técnicas para potenciar los rendimientos de producción de L-aminoácidos, incluyendo la transformación de microorganismos con ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.278.765) . Otras técnicas para potenciar los rendimientos de producción incluyen aumentar las actividades de enzimas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos y/o desensibilizar las enzimas diana de la inhibición por retroalimentación mediante el L-aminoácido resultante (véanse, por ejemplo, los documentos WO 95/16042 o las patentes estadounidenses n.os 4.346.170, 5.661.012 y 6.040.160) .

Se conocen cepas útiles en la producción de L-treonina mediante fermentación, incluyendo cepas con actividades aumentadas de enzimas implicadas en la biosíntesis de L-treonina (patentes estadounidenses 5.175.107; 5.661.012; 5.705.371; 5.939.307; EP0219027) , cepas resistentes a productos químicos tales como L-treonina y sus análogos (documentos WO0114525A1, EP301572A2, US 5.376.538) , cepas con enzimas diana desensibilizadas para la inhibición por retroalimentación mediante el L-aminoácido producido o sus subproductos (patentes estadounidenses 5.175.107; 5.661.012) , y cepas con enzimas de degradación de treonina inactivadas (patentes estadounidenses 5.939.307; 6.297.031) .

La cepa productora de treonina VKPM B-3996 conocida (patentes estadounidenses 5.175.107 y 5.705.371) es la mejor productora de treonina conocida en la actualidad. Para la construcción de la cepa VKPM B-3996, se introdujeron varias mutaciones y un plásmido, descritos a continuación, en la cepa original K-12 de E. coli (VKPM B-7) . El gen thrA mutante (mutación thrA442) codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I, que es resistente a la inhibición por retroalimentación mediante treonina. El gen ilvA mutante (mutación ilvA442) codifica para treonina desaminasa que tiene actividad disminuida que da como resultado una tasa disminuida de biosíntesis de isoleucina y un fenotipo rezumante de carencia de isoleucina. En bacterias que contienen la mutación ilvA442, la transcripción del operón thrABC no se reprime por la isoleucina, y por tanto es muy eficaz para la producción de treonina. La inactivación del gen tdh da como resultado la prevención de la degradación de la treonina. Se transfirió el determinante genético de asimilación de sacarosa (genes scrKYABR) a dicha cepa. Para aumentar la expresión de los genes que controlan la biosíntesis de treonina, se introdujo el plásmido pVIC40 que contienen el operón thrA442BC de treonina mutante en la cepa intermedia TDH6. La cantidad de L-treonina acumulada durante la fermentación de la cepa puede ser de hasta 85 g/l.

Los presentes inventores obtuvieron, con respecto a E. coli K-12, un mutante, thrR (denominado en el presente documento rhtA23) que tiene resistencia a altas concentraciones de treonina u homoserina en medios mínimos (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. and Microbiol., 21, 611-616 (1985) ) . La mutación dio como resultado la mejora en la producción de L-treonina (patente SU n.º 974817) , homoserina, y glutamato (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. and Microbiol., 27, 556-561, 1991, documento EP 1013765 A) mediante la respectiva cepa productora de E. coli, tal como la cepa VKPM B-3996. Además, los presentes inventores han revelado que el gen rhtA existe a 18 min sobre el cromosoma de E. coli cerca del operón glnHPQ que codifica para componentes del sistema de transporte de la glutamina, y que el gen rhtA es idéntico a ORF1 (gen ybiF, números 764 a 1651 en el número de registro de GenBank AAA218541, gi:440181) , ubicado entre los genes pexB y ompX. La unidad que expresa una proteína codificada por el ORF1 se ha designado como gen rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina) . Además, los presentes inventores han encontrado que la mutación rhtA23 es una substitución de A por G en la posición -1 con respecto al codón de iniciaciónATG (RESÚMENES del 17º Congreso Internacional de Bioquímica y Biología Molecular en combinación con el Encuentro Anual de 1997 de la American Society for Biochemistr y and Molecular Biology, San Francisco, California 2429 de agosto de 1997, resumen n.º 457, documento EP 1013765 A) .

En condiciones de optimización de la ruta biosintética de treonina principal, puede lograrse una mejora adicional de las cepas productoras de treonina complementando la bacteria con cantidades crecientes de precursores distantes de treonina, tales como aspartato.

Se sabe que el aspartato es un donante de carbono para la síntesis de los aminoácidos de la familia del aspartato (treonina, metionina, lisina) y diaminopimelato, un compuesto constituyente de la pared celular bacteriana. Estas síntesis se realizan mediante una ruta compleja que tiene varios puntos de ramificación y un esquema regulador extremadamente sensible. En los puntos de ramificación (aspartato, aspartato semialdehído, homoserina) , existen tantas isoenzimas como aminoácidos que se derivan de esta etapa biosintética. La aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I codificada por parte del operón thrABC provoca las reacciones primera y tercera de la biosíntesis de treonina. La treonina e isoleucina regulan la expresión de aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I, y la treonina inhibe ambas actividades para catalizar las reacciones descritas anteriormente (Escherichia coli and Salmonella, segunda edición, Editor líder: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996) .

El gen asd codifica para aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa (Asd; EC 1.2.1.11) , que es una enzima clave en las rutas biosintéticas para lisina, metionina, treonina y diaminopimelato. La aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa convierte de manera reversible L-aspartil-4-P en L-aspartato semialdehído junto con la reducción de NADP. Se da a conocer el efecto de la amplificación del gen asd en la producción de L-lisina, un aminoácido de la familia del aspartato, mediante la cepa de E. coli (patente estadounidense 6.040.160) . También se ha dado a conocer que la aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa podría ser útil para la producción de L-lisina, L-treonina y L-isoleucina mediante bacterias corineformes (documento EP 0219027 A) .

Sin embargo, no se han notificado hasta la fecha el uso de una bacteria que pertenezca al género Escherichia con actividad aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa potenciada para la producción de L-treonina.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un objeto de presente invención es potenciar la productividad de cepas productoras de L-treonina y proporcionar un método para producir L-treonina usando estas cepas.

Este objetivo se logró mediante el hallazgo de que el gen asd que codifica para aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa clonado en un vector de bajo número de copias potencia la producción de L-treonina. Por tanto, se ha completado la presente invención.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para producir L-treonina que comprende cultivar una bacteria productora de L-treonina que pertenece a Escherichia coli en el que dicha bacteria se ha modificado para potenciar una actividad de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa, tal como se define en la reivindicación 1.

La actividad de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa se potencia aumentando la expresión del gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa.

Dicha actividad de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa se potencia en una realización aumentando el número de copias del gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar la bacteria tal como se describió anteriormente, en la que el número de copias se aumenta mediante la transformación de la bacteria con un vector que contiene... [Seguir leyendo]

1. Método para producir L-treonina que comprende cultivar una bacteria productora de L-treonina que pertenece a Escherichia coli, en el que dicha bacteria se ha modificado para potenciar la actividad de aspartato-Dsemialdehído deshidrogenasa aumentando la expresión del gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa,

en el que dicha bacteria se ha modificado además para potenciar la expresión del gen thrA mutante que codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I y es resistente a la inhibición por retroalimentación mediante treonina; el gen thrB que codifica para homoserina cinasa; el gen thrC que codifica para treonina sintasa; y el gen rhtA que codifica para una proteína que confiere resistencia a homoserina y treonina, en un medio de cultivo para provocar la acumulación de L-treonina en el medio de cultivo, y recoger la L-treonina del

medio de cultivo, en el que las expresiones de los genes se potencian colocando los genes bajo el control de un promotor potente y/o aumentando el número de copias de los genes, en el que dicho promotor bajo el cual se coloca el gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa se selecciona del grupo que consiste en promotor trp, promotor trc, promotor PR y promotor PL, en el que dicho gen de aspartato-D-semialdehído deshidrogenasa codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el número de copias se aumenta mediante la transformación de la bacteria con un vector que contiene el gen.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho promotor bajo el cual se coloca el gen rhtA tiene la mutación rhtA23 que es una substitución de A por G en la posición -1 con respecto al codón de iniciación ATG.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho promotor bajo el cual se coloca el gen de aspartato-D20 semialdehído deshidrogenasa es un promotor PR.