Un método para distinguir entre Toxoplasmosis aguda y crónica en un paciente sospechoso de tener dicha Toxoplasmosis aguda o crónica que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra de ensayo, de dicho paciente, con una composición que comprende los aminoácidos 172-306 de SEC ID Nº: 54; y b) detectar anticuerpos de IgG anti T. gondii, indicando la presencia de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis aguda en dicho paciente e indicando la falta de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis crónica en dicho paciente

Antígenos de Toxoplasma gondii, P35, y usos de los mismos Antecedentes de la invención

Campo técnico

La presente invención se refiere a un antígeno que puede usarse para diferenciar entre infección aguda y crónica.

Información de antecedentes

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que se clasifica entre los Coccidia. Este parásito tiene un intervalo de hospedadores relativamente amplio infectando tanto a mamíferos como a aves. El organismo es ubicuo en la naturaleza y existen tres formas: taquizoito, quiste y ooquiste (Remington, J. S., McLeod, R., Desmonds, G., Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant (J. S. Remington y J. O. Klein, Eds.) , pág. 140-267, Saunders, Philadelphia (1995) ) . Los taquizoitos, hallados durante la infección aguda, son la forma invasiva capaz de invadir todas las células de mamífero nucleadas. Después de la etapa aguda de infección, se forman quistes tisulares llamados bradizoitos dentro de las células hospedadoras y persisten dentro de los organismos hospedadores durante la vida del hospedador. Los quistes son importantes en la transmisión de la infección, especialmente en seres humanos, puesto que la ingestión de carne cruda o poco cocinada puede dar como resultado la ingestión de bradizoitos que pueden infectar al individuo dando como resultado una infección aguda. Los ooquistes representan una etapa de reproducción sexual que aparece solamente en el revestimiento intestinal de la familia de los gatos del que se excreta en las heces.

Una infección de T. gondii adquirida a través de carne contaminada o heces de gato en un adulto sano es con frecuencia asintomática. En mujeres embarazadas y pacientes inmunosuprimidos el resultado clínico puede ser muy grave. Una infección aguda con T. gondii adquirida durante el embarazo, especialmente durante el primer trimestre, puede dar como resultado transmisión intrauterina al feto no nato dando como resultado complicaciones fetales y neonatales graves, incluyendo retraso mental y muerte fetal. La recrudescencia de una infección por T. gondii previa o una infección aguda en un individuo inmunosuprimido puede ser patogénica. La encefalitis toxoplásmica es una causa principal de morbidez y mortalidad en pacientes con SIDA. También se ha mostrado que la infección por toxoplasma es una causa significativa de coriorretinitis en niños y adultos.

El diagnóstico de infección con T. gondii puede establecerse por el aislamiento de T. gondii de sangre o fluidos corporales, demostración de la presencia del organismo en la placenta o tejidos del feto, demostración de la presencia de antígeno por detección de secuencias de ácido nucleico específicas (por ejemplo, sondas de ADN) o detección de inmunoglobulinas específicas de T. gondii sintetizadas por el hospedador en respuesta a infección usando ensayos serológicos.

La detección de anticuerpos específicos de T. gondii y determinación de la titulación de anticuerpos son herramientas importantes usadas en el diagnóstico de toxoplasmosis. Los ensayos serológicos más ampliamente usados para el diagnóstico de toxoplasmosis son el ensayo de colorante de Sabin-Feldman (Sabin, A. B. y Feldman, H. A. (1948) Science 108, 660-663) , el ensayo de hemaglutinación indirecta (IHA) (Jacobs, L. y Lunde, M. (1957) J. Parasitol. 43, 308-314) , el ensayo de IFA (Walton, B. C. et al. (1966) Am. J. Trap. Med. Hyg. 15, 149-152) , el ensayo de aglutinación (Fondation Merieux, Serologiede I'lnfectionToxoplasmiqueen Particulier a Son Debut: Methodes et Interpretation des Resultants, Lyon, 182 pág. (1975) ) y el ELISA (Naot, Y. y Remington, J. S. (1980) J. Infect. Dis. 142, 757-766) . El ensayo de ELISA es uno de los ensayos más fáciles de realizar y están disponibles en el mercado muchos ensayos serológicos automáticos para la detección de IgM e IgG específicas de toxoplasma.

Los ensayos actuales para la detección de anticuerpos de IgM e IgG en individuos infectados pueden variar ampliamente en su capacidad para detectar anticuerpos en el suero. Por lo tanto, existe una variación significativa entre ensayos vista entre los kits disponibles en el mercado. Las diferencias observadas entre los diferentes kits comerciales están causadas principalmente por la preparación del antígeno usado para el ensayo serológico. La mayoría de los kits usan taquizoitos completos o sonicados que han crecido en cultivo tisular o en ratones que contienen una alta proporción de material extraparasitario, por ejemplo, células de mamífero, componentes de cultivo tisular, etc. Debido a la falta de un antígeno purificado normalizado o método convencional para preparar el antígeno de taquizoito, no es sorprendente que exista variabilidad entre ensayos que de cómo resultado que diferentes ensayos tengan diferentes características de rendimiento con respecto a sensibilidad y especificidad de ensayo.

Dadas las limitaciones de ensayos serológicos que emplean el antígeno de taquizoito, como se ha descrito anteriormente, así como los problemas persistentes con respecto a determinación de aparición de infección, los antígenos recombinantes purificados obtenidos por biología molecular son una alternativa atractiva porque pueden purificarse y normalizarse. En la bibliografía, se han clonado y expresado varios genes de toxo en un hospedador adecuado para producir antígenos de toxo inmunorreactivos recombinantes. Por ejemplo, se han descrito los antígenos de Toxo P22 (SAG2) , P24 (GRA1) , P25, P28 (GRA2) , P30 (SAG1) , P35 (mencionado anteriormente) , P41 (GRA4) , P54 (ROP2) , P66 (ROP1) y el de Toxo P68 (Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol 43, 97-106; Cesbron-Delauw et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 7537-7541; Johnson et al. (1991) Gene 99, 127-132; Prince et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 34, 3-13; Burg et al. (1988) J. Immunol. 141, 3584-3591; Knapp et al. (1989) EPA 431541A2; Mevelec et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-238; Saavedra et al. (1991) J. Immunol. 147, 1975-1982) ; documento EPA 751 147) .

Es plausible que ningún antígeno de Toxo sencillo pueda reemplazar al taquizoito en un inmunoensayo de exploración inicial para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo. Esto puede deberse a varias razones. En primer lugar, los anticuerpos producidos durante la infección varían con la etapa de la infección, es decir, los anticuerpos producidos por un individuo infectado varían a lo largo del tiempo reaccionando con diferentes epítopos. En segundo lugar, los epítopos presentes en un antígeno recombinante pueden ser diferentes o menos reactivos que el antígeno nativo preparado a partir del taquizoito dependiendo del hospedador usado para expresión y el esquema de purificación empleado. En tercer lugar, pueden necesitarse diferentes antígenos recombinantes para detectar las diferentes clases de inmunoglobulinas producidas en respuesta a una infección, por ejemplo, IgM, IgG, IgA e IgE.

Para superar las limitaciones del antígeno de taquizoito con respecto a especificidad y sensibilidad de ensayo, se comenzó una búsqueda de nuevos antígenos de Toxo que pudieran usarse en combinación con antígenos existentes conocidos para configurar nuevos ensayos para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo.

Adicionalmente, debería observarse que la presencia de anticuerpos de IgG en una muestra sencilla de suero es suficiente para establecer que el paciente se ha infectado pero no proporciona un indicio de cuando se produjo la infección. En los Estados Unidos, no hay ningún programa de exploración serológica sistemático en mujeres embarazadas, mientras que en países tales como Francia y Austria, se obtienen sueros a intervalos regulares a lo largo de la gestación en mujeres que son seronegativas cuando se ensayan por primera vez. En los Estados Unidos, con frecuencia se toma una decisión con respecto a si la mujer se infectó recientemente, poniendo de este modo su feto en riesgo, a partir de resultados de una muestra sencilla de suero. Sin embargo, es crítico en las mujeres embarazadas determinar de forma tan precisa como sea posible si adquirieron su infección justo antes o durante la gestación. Por esta razón, la presencia de anticuerpos de IgG en una mujer embarazada con frecuencia conduce a ensayos serológicos adicionales para intentar determinar si la infección se adquirió durante el embarazo o en el pasado distante (Remington et al., 1995, Toxoplasmosis, 4ª ed., Coord. Ed., Remington, J. S., W. B. Saunders, Philadelphia, PA) . De los ensayos serológicos adicionales recomendados, se usan con más frecuencia los que demuestran la presencia de anticuerpos de IgM.... [Seguir leyendo]

1. Un método para distinguir entre Toxoplasmosis aguda y crónica en un paciente sospechoso de tener dicha Toxoplasmosis aguda o crónica que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra de ensayo, de dicho paciente, con una composición que comprende los aminoácido.

17. 306 de SEC ID Nº: 54; y b) detectar anticuerpos de IgG anti T. gondii, indicando la presencia de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis aguda en dicho paciente e indicando la falta de dichos anticuerpos de IgG Toxoplasmosis crónica en dicho paciente.

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