Polipéptido aislado tal como se menciona en SEQ ID NO: 6, que comprende una región inmunógena de un antígeno de Leishmania,

conteniendo dicho polipéptido una o más regiones de repetición de 39 aminoácidos

Polipéptidos para el diagnóstico y el tratamiento de la leishmaniosis.

Campo técnico

La presente invención se refiere a compuestos y métodos para la detección de anticuerpos anti-Leishmania en individuos que se sospecha que están infectados con el parásito protozoario del género Leishmania; especialmente, el agente infeccioso es una cepa de la India y es similar o está estrechamente relacionado con cepas de Leishmania de la India. Además, la presente invención proporciona un kit de diagnóstico que consiste en el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 6 para la detección de anticuerpos anti-Leishmania en individuos en los que se producen respuestas inmunitarias contra especies de cepas de la India y similares o estrechamente relacionadas con cepas de Leishmania de la India, y también son útiles como vacuna y agente terapéutico para prevenir y tratar la leishmaniosis. La presente invención proporciona además un kit de diagnóstico que consiste en un anticuerpo producido contra polipéptidos mostrados en SEQ ID NO: 6 para la detección de antígenos de Leishmania.

Antecedentes de la invención

La leishmaniosis, una enfermedad parasitaria transmitida por vectores, está provocada por protozoos intramacrófagos obligados. Se caracteriza por su diversidad y complejidad. Se presenta por sí misma con una amplia gama de formas clínicas. Sin embargo, hay 4 formas clínicas principales. La leishmaniosis visceral (LV), también conocida como kala azar, es la forma más grave de la enfermedad que, si no se trata, tiene una tasa de mortalidad de casi el 100%. La leishmaniosis cutánea (LC) produce úlceras en la piel en las partes expuestas del cuerpo, tales como la cara, los brazos y las piernas. El número de úlceras puede variar desde 1 hasta tantas como 200 en algunos casos, provocando discapacidad grave y dejando al paciente cicatrices permanentes. La tercera forma es la leishmaniosis mucocutánea (LMC), o espundia. Puede conducir a una destrucción extensa y desfigurante de las membranas mucosas de las cavidades de la nariz, la boca y la garganta y puede implicar incluso al cartílago. La forma cutánea puede conducir a la forma diseminada, conocida como leishmaniosis cutánea difusa (LCD). La leishmaniosis está provocada por un total de aproximadamente 21 especies, que se transmiten por aproximadamente 30 especies de moscas de arena phlebotomine [Herwaldt BL., 1999].

Actualmente, la leishmaniosis es endémica en 88 países de los cinco continentes, África, Asia, Europa, Norteamérica y Suramérica, y un total de 350 millones de personas están en riesgo de infección. Se estima que 12 millones de personas en todo el mundo están afectadas por leishmaniosis; esta cifra incluye casos con enfermedad manifiesta y aquéllos sin síntomas evidentes. De los 1,5-2 millones de nuevos casos que se estima que se producen anualmente, sólo 600000 se declaran oficialmente. De los 500000 nuevos casos de LV que se producen anualmente, el 90% son en cinco países en desarrollo: Bangladesh, Brasil, India, Nepal y Sudán. Aproximadamente el 90% de todos los casos de LMC se producen en Bolivia, Brasil y Perú y el 90% de todos los casos de LC se producen en Afganistán, Brasil, Irán, Perú, Arabia Saudí y Siria, con 1-1,5 millones de nuevos casos notificados anualmente en todo el mundo. La distribución geográfica de la leishmaniosis está limitada por la distribución de la mosca de arena, su susceptibilidad a climas fríos, su tendencia a tomar sangre de seres humano o animales sólo y su capacidad para sustentar el desarrollo interno de especies específicas de Leishmania [Desjeux P 2001].

Desde 1993, las regiones que son endémicas de Leishmania se han expandido significativamente, acompañado por un aumento brusco en el número de casos registrados de la enfermedad. La propagación geográfica se debe a factores relacionados principalmente con el desarrollo. Estos incluyen la masiva migración del medio rural al urbano y los proyectos agroindustriales que llevan a residentes urbanos no inmunes a zonas rurales endémicas. Proyectos con impacto medioambiental causados por el hombre, como presas, sistemas de irrigación y pozos, así como la deforestación, también contribuyen a la propagación de la leishmaniosis. El SIDA y otros estados inmunosupresores aumentan el riesgo de que personas infectadas con Leishmania desarrollen enfermedad visceral [Desjeux P 2001, Paredes R et al., 1997].

La LV está provocada principalmente por L. donovani en el subcontinente indio y en África, Leishmania infantum en la región mediterránea y Leishmania chagasi en el nuevo mundo; de estas especies, Leishmania chagasi y Leishmania infantum están estrechamente relacionadas. Aunque todas las especies anteriores provocan LV, son genéticamente diferentes entre sí. Los datos obtenidos por Cupolillo E et al., [1994] usando zimotaxonomía numérica mostraron que L. chagasi, la especie visceral del nuevo mundo, es similar a L. infantum del viejo mundo. El zimodemo, el serodemo y las comparaciones cuantitativas de de los patrones de fragmentos de ADN nuclear indican todos que L. chagasi y L. infantum están estrechamente relacionadas y pueden representar la misma especie. Además, el estudio de Beverley S.M et al., [1987] basado en los patrones de fragmentos de restricción de ADN nuclear revela que L. chagasi y L. infantum son similares y están tan estrechamente relacionados entre sí como dos individuos al azar de la misma población y que L. donovani es diferente de estas dos especies. En otro estudio usando análisis de secuencia de ADN repetitivo por Piarroux R et al., [1995] se observó que, entre las Leishmania que provocan LV, L. donovani se aislaba de focos en los que los seres humanos son el principal reservorio y se agrupaba en una rama independiente y en cambio, L. infantum y L. chagasi son parásitos caninos que raramente infectan a seres humanos y por tanto son diferentes. Un reciente estudio por Mauricio I.L et al., [1999] usando tres enfoques diferentes a diferentes niveles de resolución para explorar la información genética de especies de Leishmania revela una cantidad sustancial de diversidad dentro del complejo de L. donovani. Además, la RAPD había agrupado las cepas de L. donovani según el origen geográfico, específicamente la India y Kenia, mostrando una divergencia sustancial dentro del taxón.

La diversidad genética no sólo es común para L. donovani, incluso en L. major, que provoca leishmaniosis cutánea, cepas aisladas de la misma zona geográfica muestran polimorfismos de tamaño del cromosoma menores en sus cariotipos moleculares mientras que cepas de diferentes zonas geográficas muestran diferencias más significativas, lo que sugiere que los genomas de especies de Leishmania son bastante plásticos y que se producen transposiciones cromosómicas durante la evolución de diversas especies [Samaras N et al., 1987]. Actualmente, está en marcha un proyecto de mapeo genómico en L. major patrocinado por la OMS. Aunque se ha argumentado que el mapa genómico de una cepa sería aplicable a otra, hay muy pocas pruebas que corroboren esta afirmación. De hecho, se sabe que diferencias en el número de copias de genes y la organización difieren entre L. donovani, L. chagasi, L. major y otras especies. Además, es difícil conciliar las grandes diferencias en los síntomas clínicos provocados por diferentes especies con idéntico genotipo [Ghosh S.S., et al., 1998]. Por estos motivos, es necesario caracterizar genes importantes, que tienen potencial para ser un candidato de diagnóstico, vacuna o terapéutico de regiones geográficas diferentes. La asignación de la especie de parásito basándose sólo en la ubicación geográfica o el sitio de infección no es satisfactoria. Por consiguiente, la clasificación y el diagnóstico correctos del aislado de Leishmania patógena es esencial para determinar el pronóstico clínico y un enfoque terapéutico específico de especie [Marfurt J., et al., 2003]. Un posible gen de este tipo estudiado ampliamente a través de diferentes especies de regiones geográficas diferentes es Gp63, una proteasa de zinc anclada a glicolípidos de 63 kDa de tamaño [Webb J.R., et al., 1991; Steinkraus HB et al., 1993; Roberts S C et al., 1993].

En la India, la LV es un grave problema en Bihar, Bengala occidental y Uttar Pradesh oriental, donde hay una notificación menor...

1. Polipéptido aislado tal como se menciona en SEQ ID NO: 6, que comprende una región inmunógena de un antígeno de Leishmania, conteniendo dicho polipéptido una o más regiones de repetición de 39 aminoácidos.

2. Secuencia de ADN aislada tal como se menciona en SEQ ID NO: 4 que codifica para un polipéptido tal como se menciona en SEQ ID NO: 6 según la reivindicación 1.

3. Método de detección de anticuerpos anti-Leishmania en una muestra, comprendiendo dicho método:

4. Método según la reivindicación 3, en el que la muestra se selecciona de un grupo que consiste en sangre completa, suero, plasma y otro fluido corporal.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la muestra se selecciona de un animal o un mamífero incluyendo seres humanos.

6. Método según la reivindicación 3, en el que dicho soporte sólido se selecciona de un grupo que consiste en material de nitrocelulosa, nailon, partículas de látex, polipropileno y poliestireno.

7. Método según la reivindicación 3, en el que dicho portador es una partícula de oro.

8. Método según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo secundario anti-ser humano se selecciona de las clases de anticuerpos de IgG, IgM, IgA, IgE y sus subclases.

9. Método según la reivindicación 3, en el que la proteína se selecciona de un grupo que consiste en proteína A y proteína G.

10. Método según la reivindicación 3, en el que la enzima se selecciona del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, ureasa, xantina oxidasa, glucosa oxidasa y penicilinasa.

11. Método según la reivindicación 3, en el que dicho marcador se selecciona de un grupo que consiste en un resto de radioisótopo, biotina, cromóforo, fluoróforo y quimioluminiscente.

12. Método según la reivindicación 3, en el que dicha etapa de detección de anticuerpos anti-Leishmania se selecciona del grupo que consiste en detección de fluorescencia, detección de quimioluminiscencia, detección de absorbancia de luz o detección de radioisótopos.

13. Kit de diagnóstico para detectar anticuerpos anti-Leishmania que comprende un polipéptido según la reivindicación 1, un anticuerpo secundario anti-ser humano o una proteína, en el que dicho anticuerpo secundario anti-ser humano o la proteína está conjugado con una enzima o un marcador, y reactivos convencionales para detectar dichos anticuerpos.

14. Kit según la reivindicación 13, en el que dicho polipéptido está unido a un portador o soporte sólido.

15. Kit según la reivindicación 13, en el que el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en material de nitrocelulosa, nailon, partículas de látex, polipropileno y poliestireno.

16. Kit según la reivindicación 13, en el que el portador es una partícula de oro.

17. Kit según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo secundario anti-ser humano se selecciona de las clases de anticuerpos de IgG, IgM, IgA, IgE y sus subclases.

18. Kit según la reivindicación 13, en el que la proteína se selecciona de un grupo que consiste en proteína A y proteína G.

19. Kit según la reivindicación 13, en el que dicho marcador se selecciona de un grupo que consiste en un resto de enzima, radioisótopo, biotina, cromóforo, fluoróforo y quimioluminiscente.

20. Kit según la reivindicación 13, en el que la enzima se selecciona del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, ureasa, xantina oxidasa, glucosa oxidasa y penicilinasa.

21. Método de obtención de anticuerpos frente al polipéptido de la reivindicación 1, comprendiendo dicho método inyectar el polipéptido a animales, recoger los anticuerpos producidos contra el polipéptido y purificar dichos anticuerpos.

22. Método según la reivindicación 21, en el que el animal se selecciona de un grupo que consiste en ratones, conejo, caballo, cabra, oveja, cobaya, cerdo, bovinos, rata, pollo y hámsteres.

23. Método de detección de antígenos de Leishmania en una muestra usando los anticuerpos obtenidos según la reivindicación 21, comprendiendo dicho método:

24. Método según la reivindicación 23, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, médula ósea, aspirado esplénico, biopsia cutánea, biopsia de otros tejidos y frotis de secciones.

25. Método según la reivindicación 24, en el que la muestra se selecciona de un animal o un mamífero incluyendo seres humanos.

26. Método según la reivindicación 23, en el que dicho soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en material de nitrocelulosa, nailon, partículas de látex, polipropileno, vidrio y poliestireno.

27. Método según la reivindicación 23, en el que dicho portador es una partícula de oro.

28. Método según la reivindicación 23, en el que la enzima se selecciona del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano, ß-galactosidasa, ureasa, xantina oxidasa, glucosa oxidasa y penicilinasa.

29. Método según la reivindicación 23, en el que dicho marcador se selecciona de un grupo que consiste en resto de radioisótopo, biotina, cromóforo, fluoróforo y quimioluminiscente.

30. Método según la reivindicación 23, en el que dicha etapa de detección de antígenos de Leishmania se selecciona del grupo que consiste en detección de fluorescencia, detección de quimioluminiscencia, detección de absorbancia de luz o detección de radioisótopos.

31. Kit de diagnóstico para detectar antígenos de Leishmania que comprende anticuerpo frente a un polipéptido según la reivindicación 1 unido a un portador o soporte sólido, anticuerpo conjugado con una enzima o un marcador y reactivos convencionales para detectar antígenos de Leishmania.

32. Kit de diagnóstico según la reivindicación 31, en el que dicho soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en material de nitrocelulosa, nailon, partículas de látex, polipropileno, vidrio y poliestireno.

33. Kit de diagnóstico según la reivindicación 31, en el que dicho portador es una partícula de oro.

34. Kit de diagnóstico según la reivindicación 31, en el que la enzima se selecciona del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, ureasa, xantina oxidasa, glucosa oxidasa y penicilinasa.

35. Kit de diagnóstico según la reivindicación 31, en el que dicho marcador se selecciona de un grupo que consiste en un resto de radioisótopo, biotina, cromóforo, fluoróforo y quimioluminiscente.