USO DE LA PROTEINA MASP 52 PARA EL DIAGNOSTICO, EL TRATAMIENTO Y LA PREVENCION DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS.
Uso de la proteína Masp52 para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Chagas.
Se propone el uso de la proteína Masp52, de la familia MASP (Mucin associated Surface proteins) para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Chagas, incluyendo un método de detección de la presencia del parásito T. cruzi en un individuo, un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas y un kit de diagnóstico que comprende los elementos necesarios para analizar la cantidad de proteína Masp52 en una muestra biológica
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200901403.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE GRANADA.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: GRANADA.
Inventor/es: OSUNA CARRILLO DE ALBORNOZ,ANTONIO, DE PABLOS TORRO,LUIS MIGUEL, GONZALEZ GONZALEZ,GLORIA MARIBEL.
Fecha de Solicitud: 3 de Junio de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 18 de Enero de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/44 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de protozoos.
- C12Q1/68M10D
- G01N33/569B
Clasificación PCT:
- C07K14/435 C07K 14/00 […] › de animales; de humanos.
- C07K14/44 C07K 14/00 […] › de protozoos.
- C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/569 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
Fragmento de la descripción:
Uso de la proteína Masp 52 para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Chagas.
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y de la medicina, y específicamente se refiere al uso de una proteína de la familia MASP (Mucin associated Surface proteins) para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Chagas.
Estado de la técnica anterior
La enfermedad de Chagas (enfermedad de Chagas-Mazza, mal de Chagas o tripanosomiasis americana), es una enfermedad parasitaria tropical principalmente del Centro y Sudamérica, generalmente crónica, y cuyo agente etiológico es el Trypanosoma cruzi. Se estima que da lugar a unas 21,000 muertes cada año (WHO, 2002, 2005), con aproximadamente 50,000-200,000 nuevos casos diagnosticados por año (Tarleton RL, 2007. PLoS Med 4(12): e332). Aunque tradicionalmente la enfermedad se ha visto confinada a Latino América, actualmente se encuentra en expansión como consecuencia de los procesos migratorios, por lo que ha sido necesario la implantación de pruebas diagnosticas en bancos de sangre y centros de salud en aquellos países con una alta tasa de población inmigrante proveniente de zonas endémicas. Así, la incidencia de la enfermedad en dicha población inmigrante es del 16 por 1000 en Australia, 9 por 1000 en Canadá, 25 por 1000 en España y 8 a 50 por 1000 en USA. (Schmunis GA et al, 2007. Mem Inst Oswaldo Cruz. 102 Suppl 1:75-85).
T. cruzi es un protozoo flagelado, perteneciente al Orden Kinetoplástida, siendo el único de los tripanosomas que presenta una fase obligada de multiplicación intracelular en el hospedador vertebrado, siendo las formas Tripomastigote metacíclico la fase infectivas en el ciclo de vida del protozoo encargada de dicha invasión celular. El parásito transmitido al hospedador vertebrado en las heces del insecto es llamado en esta etapa, por tanto, tripomastigote metacíclico. En la sangre, el parásito se observa como un tripomastigote fusiforme, en forma de "C" o de "S" de 20 μm de largo por 1 μm de anchura. Durante esta etapa, el tripomastigote no se multiplica en la sangre del hospedero. Cuando el parásito infecta las fibras del músculo cardiaco estriado o a los fagocitos, se acorta el flagelo y se transforma en un amastigote redondo de 2 a 5 μm de diámetro y con un flagelo externo muy corto o inexistente, este se multiplica por medio de fisión binaria formando "racimos" o "nidos" que se acumulan en la célula huésped hasta que esta se rompe. Los parásitos liberados de la célula se convierten en tripomastigotes sanguíneos, que son liberados a la sangre circulante, son de un tamaño total que varía entre 15 y 20 μm, tienen flagelo libre, un cinetoplasto voluminoso, terminal o subterminal, y un núcleo oval. Estos tripomastigotes pueden infectar otras células, pero no son capaces de multiplicarse en la sangre ya que la única forma replicativa en el vertebrado es la forma amastigote intracelular, invadiendo otras células para repetir el ciclo.
Los hospedadores invertebrados adquieren el parásito al alimentarse del hombre o de los animales domésticos o silvestres infectados. Los tripomastigotes migran al intestino medio del insecto donde se transforman en epimastigotes, flagelados anchos, muy móviles, con el cinetoplasto entre el núcleo y el flagelo libre. Allí se dividen un gran número de veces, quedando el insecto infectado de por vida. Los epimastigotes, se transforman en tripomastigotes metacíclicos y migran al intestino posterior de donde son excretados con las heces en el momento de la picadura.
Cualquier proceso infeccioso biológico puede dividirse en diversos grados según su severidad y en función de los tratamientos necesarios para aliviar sus síntomas. En el caso de las infecciones causadas por Trypanosoma cruzi en el hombre, la enfermedad presenta dos estados severos: la fase aguda, poco después de la infección, y la fase crónica que puede desarrollarse incluso pasados diez años. En el caso de las infecciones causadas por Trypanosoma cruzi, algunos casos agudos (10 a 20%) se resuelven en un periodo de dos a tres meses dando lugar a una fase crónica asintomática ahora llamada fase indeterminada, la cual se caracteriza por la persistencia de la infección sin presentar problemas clínicos, para reaparecer sólo varios años más tarde.
Los métodos de diagnóstico incluyen principalmente técnicas serológicas, y éstas pueden ser hemaglutinación directa o indirecta, IFA (inmunofluorescencia indirecta), reacción de fijación de complemento y ELISA, así como el examen microscópico de la interfase de células después de centrifugar la sangre (Stront y microStront), y el hemocultivo. Estos y otros métodos muestran diferente sensibilidad y especificidad. Durante la fase aguda el xenodiagnóstico es la prueba más sensible (92%), la cual puede ser usada también para el estudio de la susceptibilidad de los animales de laboratorio ante diferentes cepas de T. cruzi. Mientras el xenodiagnóstico se ha mostrado negativo después del tratamiento con tripanocidas efectivos, pruebas serológicas convencionales como la inmunofluorescencia y la fijación de complemento persisten positivas. Consecuentemente, la evaluación de la curación es aún controvertida. Por medio de la prueba de lisis mediada por el complemento (CML), se detectaron anticuerpos líticos (LA) de T. cruzi que se adosan a los epítopos de tripomastigotes vivos y están relacionados con la resistencia del huésped a la infección (Krettli et al., 1982. Trans R Soc Trop Med Hyg 76(3):334-340). La serología de anticuerpos convencionales (CSA) detecta inmunoglobulinas en sueros de pacientes con infecciones chagásicas, pero a diferencia de los LA, no reconoce tripomastigotes vivos. La presencia de LA se ha usado como un importante criterio de evaluación de la enfermedad de Chagas.
Usando la citometría de flujo, se Introdujo un inmunométodo sensible para la detección de anticuerpos antitripomastigotes vivos ligados a la membrana (Martins-Filho et al. 1995. Clin Diagn Lab Immunol 2(5):569-573). Con base en las pruebas serológicas (detección de LA -lytic antibodies- y CSA -conventional serology antibodies-) y en evaluaciones parasitológicas como hemocultivo (HE), es posible clasificar a los pacientes en:
a) pacientes no tratados infectados crónicamente (NT) y pacientes tratados no curados (TNC), con HE positivo y anticuerpos LA y CSA en su suero;
b) pacientes "disociados" (DIS); es decir, con HE-negativo, en los cuales los LA no se detectan mientras los CSA están presentes;
c) pacientes curados (CUR), con HE-negativo, que no tienen anticuerpos LA ni CSA, y
d) como control, un grupo de personas no chagásicas (NC).
Se examinan los sueros de los pacientes por incubación de tripomastigotes vivos del torrente circulatorio, los cuales han sido expuestos a isotiocianato de fluoresceína conjugado con inmunoglobulina G antihumano. Los parásitos se fijan, se corren en el citómetro y se identifican con base en su tamaño y sus granulaciones. Con la experiencia en la prueba de CLM se usa un nivel de 20% de parásitos positivos a la fluorescencia del conjugado como línea de corte entre los tratamientos efectivos y los no efectivos.
Es fundamental el diagnóstico diferencial que permita distinguir en que fase de desarrollo se encuentra la enfermedad, así como la monitorización del transcurso de la misma, especialmente en la fase crónica, para eliminar o reducir al mínimo los mecanismos autoinmunes, que causan efectos negativos e incluso letales, en los pacientes. Además, los dos únicos medicamentos disponibles para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son el Nifurtimox, desarrollado en 1960 por Bayer y el Benzinidazol, desarrollado en 1974 por Roche. Ambos poseen una baja tasa de curación y efectos secundarios.
La familia de proteínas MASPs (Mucin associated Surface Proteins) se describió por primera vez a raíz de la secuenciación del genoma entero del parásito Trypanosoma cruzi, y parece exclusiva del mismo. Tal y como se describe en El Sayed et al., 2005. (Science, 309, 409), existen más de 1300 copias de genes MASP, (1377 genes identificados) y se han denominado así por encontrarse aguas debajo de las mucinas TcMUC II (subfamilia de mucinas de 884 miembros), y parecerse estructuralmente a ellas (aunque no a nivel de secuencia). De los 1377 genes MASPs indentificados, 771 parecen codificar regiones N-terminal...
Reivindicaciones:
1. Método de detección de la presencia del parásito T. cruzi en un individuo, que comprende:
2. Método de detección de la presencia del parásito T. cruzi en un individuo según la reivindicación anterior, en el que el individuo del paso (a) es un mamífero.
3. Método de detección de la presencia del parásito T. cruzi en un individuo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el individuo del paso (a) es un mamífero humano.
4. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, que comprende:
5. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas según la reivindicación anterior, que comprende además:
6. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que la detección de la cantidad de proteína Masp52 se realiza mediante la incubación con un anticuerpo específico en un inmunoensayo.
7. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el inmunoensayo es un Western blot.
8. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Chagas según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el Western blot se lleva a cabo empleando IgG anti-CR.
9. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Chagas según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el Western blot se lleva a cabo empleando IgG anti-SP.
10. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Chagas según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que la detección de la cantidad de proteína Masp52 se realiza mediante RTqPCR.
11. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Chagas según la reivindicación anterior, donde la RTqPCR se lleva a cabo empleando los cebadores cuya secuencia se recoge en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
12. Uso de la proteina Masp52 aislada, o cualquiera de sus variantes, para la elaboración de un medicamento.
13. Uso de la proteína Masp52 aislada, o cualquiera de sus variantes, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Chagas.
14. Anticuerpos generados por la inmunización de un animal con la proteína Masp52, o cualquiera de sus variantes.
15. Uso de los anticuerpos generados por la inmunización de un animal con la proteína Masp52 para la elaboración de un medicamento.
16. Uso de los anticuerpos generados por la inmunización de un animal con la proteína Masp52 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Chagas.
17. Composición que comprende la proteína Masp52 según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, o un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.
18. Composición según la reivindicación 17, que además comprende excipientes farmacológicamente aceptables.
19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, que es una vacuna.
20. Composición según la reivindicación anterior, que además comprende un adyuvante.
21. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, donde donde la vacuna presenta un origen recombinante.
22. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, que adicionalmente comprende otro principio activo.
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