Anticuerpo IgG4 humano, en el que la serina en la posición 228 y la leucina en la posición 235 en la regiónconstante de la cadena pesada de IgG4,

que están indicadas en el índice EU como en Kabat et al., están sustituidaspor prolina y ácido glutámico, respectivamente, y la arginina en la posición 409 en una región constante de la cadenapesada de IgG4 humana, que está indicada en el índice EU como en Kabat et al., está sustituida por lisina, treonina,metionina o leucina.

Anticuerpos IgG4 humanos estabilizados.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un mutante IgG4 que tiene propiedades físicas mejoradas, que se obtiene introduciendo la mutación en una región constante de IgG4 humana.

Antecedentes de la técnica

Las inmunoglobulinas son glucoproteínas que existen en el suero y el tejido/fluido corporal de todos los mamíferos. Las inmunoglobulinas tienen una función de reconocimiento de antígenos extraños. Las inmunoglobulinas están implicadas en la defensa biológica mediante la activación de sus funciones efectoras. Las funciones efectoras implican la activación del sistema del complemento, que es inducida por el enlace antígeno-anticuerpo, y los efectos de activación de la fagocitosis celular, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, la liberación de mediadores, y receptores de Fc (FcR) para la presentación de antígenos que existen en la superficie celular.

Existen 5 clases diferentes de inmunoglobulinas humanas, a saber, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. La IgG se puede clasificar en las 4 subclases de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Además, IgA se puede clasificar en los 2 subclases de IgA1 y IgA2. La estructura básica de la inmunoglobulina se compone de 2 cadenas L homólogas (cadenas ligeras) y 2 cadenas H homólogas (cadenas pesadas) . La clase y la subclase de inmunoglobulina están determinadas por las cadenas H.

Diferentes inmunoglobulinas se sabe que tienen diferentes funciones. Por ejemplo, el nivel de capacidad de unión al complemento se clasifica en el orden siguiente: IgM> IgG3> IgG1> IgG2. Además, el nivel de afinidad a FcyRI (receptor Fc I) se clasifica en el siguiente orden: IgG3> IgG1> IgG4> IgG2. Además, IgG1, IgG2 e IgG4 pueden unirse a la proteína A.

Los anticuerpos humanos que se han recogido y purificado a partir de sangre se utilizan como agentes farmacéuticos. En los últimos años, muchos anticuerpos monoclonales han sido sometidos a pruebas clínicas. Además, muchos de dichos anticuerpos se han colocado en el mercado. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos monoclonales utilizados como agentes farmacéuticos que se han colocado en el mercado o desarrollado clínicamente proceden de la IgG1. Muy pocos de dichos anticuerpos proceden de la IgG4. Se ha sabido que la IgG4 se caracteriza por tener niveles de activación del complemento más bajos y de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo que IgG1. Por lo tanto, se considera que los productos derivados de IgG4 son apropiados para su utilización como agentes farmacéuticos que tienen dichas características. En la activación de la función efectora de un anticuerpo que se une a un antígeno, una célula que expresa el antígeno se daña por medio de un sistema de complemento u otra célula. En un caso en el que dicho antígeno es un antígeno específico del cáncer o similar, la función de daño celular es muy importante en términos de propiedades medicinales. Sin embargo, en los casos de algunos antígenos, dicha función podría causar efectos desfavorables. Un ejemplo de dicho antígeno es CD40. El gen CD40 desempeña una función importante en el control inmunológico. Los anticuerpos anti-CD40 que inhiben la unión entre un ligando CD40 y CD40 se considera que tienen un alto potencial como agentes farmacéuticos. Sin embargo, la expresión de CD40 se encuentra en varios otros tipos de células, además de inmunocitos. Por lo tanto, si la función efectora de dicho anticuerpo causa daño a una célula que expresa CD40, hay una posibilidad de que podrían producirse graves efectos desfavorables. Por lo tanto, se considera que IgG4 es un anticuerpo preferente contra dichos antígenos mencionados.

Mientras tanto, a fin de producir IgG4 que actúa como agente farmacéutico, deben considerarse ciertos problemas. Dichos problemas implican la existencia de un medio anticuerpo IgG4 que no tiene enlace SS entre sus cadenas H in vivo. (Un anticuerpo comprende generalmente 2 cadenas L y 2 cadenas; sin embargo, una mitad de anticuerpo comprende una sola cadena L y una sola cadena H.) Además, es problemática la producción de un una mitad de anticuerpo en un caso en el que IgG4 se expresa en células animales tales como CHO para la producción de un agente farmacéutico. Dicha formación de medio anticuerpo es un problema serio que es una causa para asuntos en relación con la producción de agentes farmacéuticos. Sin embargo, se ha publicado que la formación de la mitad de anticuerpo puede inhibirse introduciendo una sustitución de un solo aminoácido en una región constante (véase el documento 1 no de patente) . Aalberse et al., Immunology, 2002, 105 (I) :9-19 informan de que la base estructural para la monovalencia funcional de IgG4 se debe en gran medida a un cambio de un solo aminoácido con respecto a la IgG1 humana en la bisagra del núcleo. Además, aunque se sabe que IgG4 tiene un menor nivel de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en comparación con IgG1, IgG4 tiene capacidad de unión de FcR, aunque a un nivel débil. Sin embargo, dicha capacidad de unión de FcR puede atenuarse más introduciendo una mutación en una región de la bisagra de IgG4 para mejorar la IgG4 (véase los documentos de patente 1 a 3) .

De acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, se hace posible producir IgG4 casi ideal. Sin embargo, por lo que se refiere a la producción de un agente farmacéutico que comprende IgG4, existen todavía problemas que deben superarse. Dichos problemas implican la inestabilidad de los anticuerpos IgG4 a pH bajo. En general, se utiliza un procedimiento de purificación por afinidad con la utilización de proteína A para producir anticuerpos como agentes farmacéuticos. En tal caso, un tampón de pH bajo se utiliza a menudo para la elución de anticuerpos que unen cada uno a la proteína A. Además, para eliminar los virus, se desea que los anticuerpos se traten a pH bajo durante un cierto período. Sin embargo, como se muestra en la presente invención, se ha conocido que anticuerpos IgG4 son propensos a formar un conglomerado, ya que tienen una mala estabilidad a pH bajo en comparación con los anticuerpos IgG 1. Se ha publicado que la incorporación de un conglomerado en un agente farmacéutico produce la activación de reacciones de infusión, la activación del complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Por lo tanto, es fácil suponer que dichas reacciones y similares dan lugar a efectos desfavorables. Por consiguiente, es muy importante reducir la cantidad de conglomerados lo menos posible.

[Documento 1 de patente] Patente JP nº 3101690 [Documento 2 de patente] US nº 5.648.260 [Documento 3 de patente] US nº 5.624.821 [Documento 1 no de patente] S. Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30, 105-108

Descripción de la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en producir un mutante muy estabilizado de anticuerpo IgG4 humano.

Como resultado de estudios exhaustivos, se ha conseguido producir un mutante de IgG4 humana en el que se mantiene la actividad de anticuerpos y las propiedades físicas se mejoran en comparación con la conocida IgG4 humana. Esto ha conducido a la realización de la presente invención. La idea básica de la modificación de la IgG4 humana en la presente invención se describirá a continuación con detalle.

En la región constante de la cadena pesada de IgG4 humana, al menos un dominio CH3 está sustituido por un dominio CH3 de la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana. Alternativamente, en la región constante de la cadena pesada de IgG4 humana, al menos los dominios CH2 y CH3 están sustituidos por dominios CH2 y CH3 de la IgG1 humana, respectivamente. Por lo tanto, la estabilidad del anticuerpo puede mejorarse. Además, la arginina (R) en la posición 409 de la IgG4 humana está sustituida por lisina (K) , treonina (T) , metionina (M) , o leucina

(L) (por ejemplo, la sustitución de arginina (R) en la posición 409 con lisina (K) , en adelante denominada "R409K" en algunos casos) de tal manera que puede mejorarse la estabilidad del anticuerpo. (Cada letra del alfabeto representa un aminoácido correspondiente y cada número es un número según el índice de EU propuesto por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 quinta edición) ) .

Además, si es posible sustituir D270, K322, P329 o P331 con A o convertir P331 en S o G, la actividad de CDC puede reducirse.

Asimismo, si es posible sustituir L235 por E y G237 con A, la actividad de ADCC... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo IgG4 humano, en el que la serina en la posición 228 y la leucina en la posición 235 en la región constante de la cadena pesada de IgG4, que están indicadas en el índice EU como en Kabat et al., están sustituidas por prolina y ácido glutámico, respectivamente, y la arginina en la posición 409 en una región constante de la cadena pesada de IgG4 humana, que está indicada en el índice EU como en Kabat et al., está sustituida por lisina, treonina, metionina o leucina.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo producido por el hibridoma 4D11, nº de registro: FERM BP-7758.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada mostrada por la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada representada por la SEC ID nº 2 y una región variable de la cadena ligera mostrada por la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera representada por la SEC ID nº 4.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada codificada por una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada representada por la SEC ID nº 1 y una región variable de la cadena ligera codificada por una secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera representada por la SEC ID nº 3.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada de IgG4 humana tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 44, y la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 46.

6. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada de IgG4 humana es una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada representada por la SEC ID nº 43, y la cadena ligera es una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera representada por la SEC ID nº 45.

7. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo anti-CD40.

8. Procedimiento in vitro para producir un anticuerpo IgG4 humano, que comprende las etapas siguientes:

sustituir la serina en la posición 228 y la leucina en la posición 235 en la región constante de la cadena pesada de IgG4, que están indicadas en el índice EU como en Kabat et al., por prolina y ácido glutámico, respectivamente, y

sustituir la arginina en la posición 409 en una región constante de la cadena pesada de IgG4 humana, que está indicada en el índice EU como en Kabat et al., por lisina, treonina, metionina o leucina.

9. Procedimiento in vitro para inhibir el agregado de anticuerpos de un anticuerpo de IgG4 humano, en el que la serina en la posición 228 y la leucina en la posición 235 en la región constante de la cadena pesada de IgG4, que están indicadas en el índice EU como en Kabat et al., están sustituidas por la prolina y el ácido glutámico, respectivamente, y la arginina en la posición 409 en una región constante de la cadena pesada de IgG4 humana, que está indicada en el índice EU como en Kabat et al., está sustituida por lisina, treonina, metionina o leucina.

10. Procedimiento in vitro para producir un anticuerpo IgG4 humano, que comprende las etapas siguientes:

producir un vector de expresión que tiene genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

introducir el vector de expresión en un hospedador;

cultivar el hospedador; y

obtener el anticuerpo del producto de cultivo.

11. Procedimiento in vitro para producir un anticuerpo IgG4 humano, que comprende las etapas siguientes:

producir un vector de expresión que tiene una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada representada por la SEC ID nº 47 y una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera representada por la SEC ID nº 45;

introducir el vector de expresión en un hospedador;

cultivar el hospedador; y obtener el anticuerpo del producto de cultivo.

12. Composición farmacéutica que comprende, como principio activo, el anticuerpo según cualquiera de las 5 reivindicaciones 3 a 7.

13. Agente terapéutico para el tratamiento del rechazo al trasplante, enfermedades autoinmunitarias, cáncer, arteriosclerosis, nefritis, enfermedad de Alzheimer, o amiloidosis, que comprende, como principio activo, el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.