Anticuerpos contra IL-12 humana.

Un anticuerpo monoclonal anti-IL-12 humana, que comprende una subunidad p35 y una subunidad p40 que forman un heterodímero p75,

en el que dicho anticuerpo monoclonal reconoce la subunidad p40 de IL-12 humana y neutraliza al menos 90% de la bioactividad de IL-12 humana medida por:

(a) la inhibición de la proliferación de linfoblastos humanos activados por fitohemaglutinina (PHA) estimulada por IL12, en el que la concentración de dicho anticuerpo monoclonal es 0, 5 μg/ml y la concentración de dicha IL-12 humana es 0, 25 ng/ml o

(b) la inhibición de la producción de IFN-γ por linfoblastos humanos activados por PHA estimulada por IL-12, en el que la concentración de dicho anticuerpo es 0, 5 μg/ml y la concentración de dicha IL-12 humana es 0, 25 ng/ml y en el que dicho anticuerpo monoclonal se puede obtener de un ratón deficiente en un gen de la subunidad p35 o p40 de IL-1-12.

Anticuerpos contra IL-12 humana.

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-IL-12 humana, que comprende una subunidad p35 y una subunidad p40 que forman un heterodímero p75, en donde dicho anticuerpo monoclonal reconoce la subunidad p40 de IL-12 humana y neutraliza al menos 90% de la bioactividad de IL-12 humana medida por

(a) la inhibición de la proliferación de linfoblastos humanos activados por fitohemaglutinina (PHA) estimulada por IL12, en donde la concentración de dicho anticuerpo monoclonal es 0, 5 μg/ml y la concentración de dicha IL-12 humana es 0, 25 ng/ml y

(b) la inhibición de la producción de IFN-γ por linfoblastos humanos activados por PHA estimulada por IL-12, en donde la concentración de dicho anticuerpo es 0, 5 μg/ml y la concentración de dicha IL-12 humana es 0, 25 ng/ml y

en donde dicho anticuerpo monoclonal se puede obtener de un ratón deficiente en un gen de la subunidad p35 o p40 de IL-12.

En una realización, dicho anticuerpo monoclonal presenta reactividad cruzada con IL-12 de mono Rhesus. En otra realización, dicho anticuerpo monoclonal está humanizado. En otra realización, dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo con una única cadena.

La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de la invención. En una realización, dicha composición es adecuada para la administración parenteral.

La invención se refiere además al uso de dicho anticuerpo monoclonal en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno autoinmune. En una realización, el trastorno autoinmune es esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus autoinmune o enfermedad inflamatoria del intestino. En una realización, la enfermedad intestinal inflamatoria es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. La invención también se refiere al uso de dicho anticuerpo monoclonal en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad injerto contra huésped o choque séptico.

La interleuquina-12 (IL-12) , primeramente conocida como factor de maduración de linfocitos citotóxicos o factor estimulante de células asesinas naturales, es una citoquina heterodímera de 75 kDa (p75) compuesta por subunidades de 40 kDa (p40) y 35 kDa (p35) unidas por disulfuro. Las subunidades p40 y p35 son polipéptidos que contienen 306 residuos de aminoácido y 197 residuos de aminoácido, respectivamente (Gubler U. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, 4143-4147 (1991) ) .

El heterodímero p75 es la forma biológicamente activa de IL-12 (Gubler, U. y otros, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4143; Wolf, S.F. y otros, 1991, J. Immunol., 146: 3074) . El heterodímero p75 de IL-12 tanto activa como refuerza respuestas inmunitarias mediadas por células contra antígenos extraños estimulando la producción de células cooperadoras Th 1, estimulando células T activadas y células asesinas naturales (NK) , potenciando la actividad lítica de células NK/LAK y estimulando la producción de IFN-γ por células T y NK en reposo y activadas.

45 Se ha observado que la subunidad p40 de IL-12 es producida en exceso de la subunidad p35 y se encuentra en las formas tanto monómera como dímera (Podlaski, F.J. y otros, 1992, Arch. Biochem. Biophys. 294: 230; D’Andrea, A. y otros, 1992, J. Exp. Med., 176: 1387) . El homodímero p40 de IL-12 es un potente antagonista de IL-12 (Ling, P. y otros, 1995, J. Immunol., 154: 116; Gillessen, S. y otros, 1995, Eur. J. Immunol., 25: 200) . En contraste con la subunidad p40, la subunidad p35 de IL-12 no tiene actividad biológica conocida y la proteína p35 sólo se ha encontrado en asociación con la subunidad p40 como parte del heterodímero p75 de IL-12. Por lo tanto, existen dos tipos importantes de epítopos presentados por IL-12 humana: (1) epítopos presentados por la subunidad p40 y (2) epítopos presentados por la conformación tridimensional del heterodímero p75 de IL-12. Por consiguiente, los presentes inventores diseñan anticuerpos que reconocen epítopos presentes sobre la proteína heterodímera p75 de IL-12 pero no reconocen epítopos presentes sobre la proteína de la subunidad p40 de IL-12 llamados anticuerpos 55 “específicos para el heterodímero”.

Se ha encontrado que los anticuerpos para IL-12 conocidos no son óptimamente eficaces para neutralizar substancialmente la bioactividad de IL-12. Los anticuerpos para IL-12 que reaccionan inmunológicamente con la subunidad p40 no bloquean óptimamente la bioactividad de IL-12 humana. Por ejemplo, el uso de anticuerpos que reaccionan con epítopos presentados por la subunidad p40 es particularmente problemático debido a que se ha observado que la producción de heterodímero p75 de IL-12 da como resultado un exceso de subunidades p40 inactivas con relación al heterodímero p75 bioactivo (Podlaski, F.J., 1992, Arch. Biochem. Biophys. 294: 230; D’Andrea, A. y otros, 1992, J. Exp. Med., 176: 1387) . Como resultado, los anticuerpos para p40 no son tan eficaces como los anticuerpos específicos para el heterodímero para reducir los efectos perjudiciales de la IL-12 debido a que 65 la subunidad p40 sola no es bioactiva, y los anticuerpos para p40 tienden a unirse a las subunidades p40 inactivas en vez de a aquellas subunidades p40 que son parte de un heterodímero p75 bioactivo.

Ni siquiera los anticuerpos conocidos que reaccionan sólo con el heterodímero p75 neutralizan eficazmente la bioactividad de IL-12. Por ejemplo, un anticuerpo específico para el heterodímero p75 de IL-12 previamente identificado, llamado 20C2 (Chizzonite y otros, Cytokine, 6: A82a (1994) y D’Andrea y otros, J. Exp. Med., Vol. 176, 1387-1398 (1992) ) , no puede bloquear substancialmente la proliferación de linfoblastos activados por PHA ni la producción de IFN-γ estimuladas por IL-12 humana.

Las siguientes referencias también divulgan anticuerpos o antisueros anti-IL-12. Müller y otros (J Clin Invest. 1994 November; 94 (5) : 1799-1805) divulgan un anticuerpo monoclonal anti-IL-12 humana de rata que inhibía la proliferación de células T en aproximadamente 50%. Sriskandan y otros. (J Immunol. 1996 Apr 1;156 (7) :2430-2435) divulga un anticuerpo anti-IL-12 de cabra neutralizante. Balashov y otros. (Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Januar y 21; 94 (2) : 599-603) divulga un anticuerpo anti-IL-12 humana de cabra neutralizante. Fratazzi y otros (Clin Immunol Immunopathol. 1998 Jan;86 (l) :34-44) divulga un anticuerpo monoclonal anti-IL-12 humana que no tenía ningún efecto sobre la proliferación de células T ni actividad citotóxica CD8+ inducida por IL-7 y sCD23. Ohshima y Delespesse (J Immunol. 1997 Jan 15;158 (2) :629-636) divulgan un anticuerpo anti-IL-12 humana de cabra. Wu y otros (J Immunol. 1994 Feb 1;152 (3) : 1141-1153) divulgan la purificación de rIL-12 utilizando una columna anti-IL-12. Tripp y otros (J Immunol. 1994 Feb 15; 152 (4) : 1883-1887) divulgan fracciones de IgG de suero de cabra anti-IL-12 de ratón.

Anticuerpos específicos para el heterodímero que neutralicen más eficazmente la bioactividad de IL-12 son necesarios para reducir efectos perjudiciales de IL-12. Se sabe que los niveles incrementados de IL-12 en suero o tejido están implicados en el desarrollo y el avance de trastornos autoinmunes. Así, los anticuerpos para IL-12 son antagonistas útiles para controlar enfermedades con patologías que están mediadas a través de mecanismos inmunes, particularmente enfermedades asociadas con actividad de células cooperadoras tipo Th1 aberrantes. Ejemplos de tales trastornos autoinmunes incluyen esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, artritis reumatoide y diabetes mellitus autoinmune. Otros estados patológicos que se ha observado que se benefician de la administración de anticuerpos para IL-12 incluyen enfermedad del trasplante/injerto contra el huésped y choque séptico.

De acuerdo con esta invención, se ha encontrado que anticuerpos para IL-12 obtenidos de un mamífero deficiente en el gen que codifica la subunidad p35 y/o el gen que codifica la subunidad p40 neutralizan substancialmente la bioactividad de IL-12.

De acuerdo con esta invención, por primera vez, se producen anticuerpos que neutralizan substancialmente la bioactividad de IL-12 humana usando los métodos descritos aquí. A diferencia de otros anticuerpos específicos IL

12, los anticuerpos descritos aquí neutralizan al menos 90% de la bioactividad de IL-12 humana. Además, los anticuerpos descritos aquí... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal anti-IL-12 humana, que comprende una subunidad p35 y una subunidad p40 que forman un heterodímero p75, en el que dicho anticuerpo monoclonal reconoce la subunidad p40 de IL-12 humana y 5 neutraliza al menos 90% de la bioactividad de IL-12 humana medida por:

(a) la inhibición de la proliferación de linfoblastos humanos activados por fitohemaglutinina (PHA) estimulada por IL12, en el que la concentración de dicho anticuerpo monoclonal es 0, 5 μg/ml y la concentración de dicha IL-12 humana es 0, 25 ng/ml o (b) la inhibición de la producción de IFN-γ por linfoblastos humanos activados por PHA estimulada por IL-12, en el que la concentración de dicho anticuerpo es 0, 5 μg/ml y la concentración de dicha IL-12 humana es 0, 25 ng/ml y en el que dicho anticuerpo monoclonal se puede obtener de un ratón deficiente en un gen de la subunidad p35 o p40 de IL-12.

2. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo monoclonal reacciona cruzadamente con IL-12 de mono Rhesus.

3. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo monoclonal está 20 humanizado.

4. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo con una única cadena.

5. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicha composición es adecuada para la administración parenteral. 30

7. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastornos autoinmune.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho trastorno autoinmune es esclerosis múltiple, artritis 35 reumatoide, diabetes mellitus autoinmune o enfermedad inflamatoria del intestino.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha enfermedad inflamatoria del intestino es enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.

10. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped o el choque séptico.

11. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno autoinmune. 45

12. El anticuerpo monoclonal para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho trastorno autoimmune es esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus autoinmune o enfermedad inflamatoria del intestino.

13. El anticuerpo monoclonal para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha enfermedad 50 inflamatoria del intestino es enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.

14. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en un método para el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped o el choque séptico.