Anticuerpos contra factor de crecimiento de tejido conjuntivo.

Un anticuerpo o porción del mismo que se une específicamente a al menos una parte de una región sobre CTGF humano definida como los aminoácidos 143 a 154 de SEC ID Nº :

2 o a una región ortóloga sobre CTGF derivada de otras especies.

Anticuerpos contra factor de crecimiento de tejido conjuntivo Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF) . Los anticuerpos están particularmente dirigidos a regiones de CTGF que participan en actividades biológicas asociadas a diversos trastornos.

Antecedentes Factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF)

El CTGF es una glicoproteína secretada de unión a heparina rica en cisteína de 36 kD originalmente aislada de medios de cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (véanse, por ejemplo, Bradham y col. (1991) J Cell Biol 114:1285-1294; Grotendorst y Bradham, patente de EE.UU. nº 5.408.040) . El CTGF pertenece a la familia CCN (CTGF, Cyr61, Nov) de proteínas (glicoproteínas secretadas) que incluye el producto génico temprano inmediato inducido por suero Cyr61, el oncogén putativo Nov, la proteína asociada a ECM FISP-12, el gen inducible por src CEF-10, la proteína secretada inducible por Wnt WISP-3 y la proteína antiproliferativa HICP/rCOP (Brigstock (1999) Endocr Rev 20:189-206; O'Brian y col. (1990) Mol Cell Biol 10:3569-3577; Joliot y col. (1992) Mol Cell Biol 12:10-21; Rysecky col. (1990) Cell Growth and Diff 2:225-233; Simmons y col. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1178-1182; Pennica y col. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A, 95:14717-14722; y Zhang y col. (1998) Mol Cell Bio 18:6131-6141) . Las proteínas CCN se caracterizan por la conservación de 38 residuos de cisteína que constituyen más del 10% del contenido de aminoácidos totales y dan lugar a una estructura modular con dominios del extremo N y C. La estructura modular de CTGF incluye motivos conservados para la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-BP) y factor von Willebrand (VWC) en el dominio del extremo N, y trombospondina (TSP1) y un motivo de nudo de cisteína en el dominio del extremo C.

La expresión de CTGF se induce por miembros de la superfamilia de los factores de crecimiento transformantes beta (TGFº) que incluye TGFº-1, -2 y -3, proteína morfogenética ósea (BMP) -2 y activina, además de una variedad de otros moduladores reguladores que incluyen dexametasona, trombina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiotensina 11; y estímulos medioambientales que incluyen hiperglucemia e hipertensión (véanse, por ejemplo, Franklin (1997) Int J Biochem Cell Biol 29:79-89; Wunderlich (2000) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238:910-915; Denton y Abraham (2001) Curr Opin Rheumatol 13:505-511; y Riewald (2001) Blood 97:3109-3116; Riser y col. (2000) J Am Soc Nephrol 11:25-38; y la publicación internacional nº WO 00/13706) . La estimulación por TGFº de la expresión de CTGF es rápida y prolongada y no requiere aplicación persistente (Igarashi y col. (1993) Mol Biol Cell 4: 637-645) . La expresión potenciada de CTGF por TGFº implica la activación transcripcional por elementos reguladores del ADN presentes en el promotor de CTGF (Grotendorst y col. (1996) Cell Growth Differ 7: 469-480; Grotendorst y Bradham, patente de EE.UU. nº 6.069.006; Holmes y col. (2001) J Biol Chem 276:1059410601) .

Se ha mostrado que el CTGF aumenta la transcripción en estado estacionario de ARNm de a1 (I) colágeno, a5 integrina y fibronectina, además de promover los procesos celulares que incluyen proliferación y quimiotaxia de diversos tipos de células en cultivo (véanse, por ejemplo, Frazier y col. (1996) J Invest Dermatol 107:406-411; Shiwen y col. (2000) Exp Cell Res 259:213-224; Klagsbum (1977) Exp Cell Res 105:99-108; Gupta y col. (2000) Kidney Int 58:1389-1399; Wahab y col. (2001) Biochem J 359 (Pt 1) :77-87; Uzel y col. (2001) J Per y odontol 72:921-931; y Riser y Cortes (2001) Ren Fail 23:4599470) . La inyección subcutánea de CTGF en ratones neonatales produce la deposición local de tejido de granulación. Similarmente, la inyección subcutánea de TGFº genera la formación de tejido de granulación e induce altos niveles de ARNm de CTGF en fibroblastos locales. Además, la combinación o el tratamiento secuencial con TGFº y CTGF produce el desarrollo de un granuloma más persistente (Mori y col. (1999) J Cell Physiol 181:153-159) . Por tanto, parece que el CTGF media en un subconjunto de efectos provocados por TGFº, en particular la producción y deposición de matriz extracelular (ECM) . Además, la capacidad de responder a CTGF, o el grado de respuesta de CTGF, puede basarse en un estímulo de sensibilización proporcionado por el tratamiento con TGFº que permite "competencia" celular (publicación internacional nº WO 96/08140) .

Aunque se ha caracterizado una plétora de factores interactuantes que modulan la organización de tejido, ahora está emergiendo un consenso para la función de CTGF en la regulación del desarrollo esquelético, cicatrización y remodelación de la matriz extracelular (ECM) , fibrosis, tumorigénesis y angiogénesis. Por ejemplo, se ha observado elevada expresión de CTGF en hígado cirrótico, fibrosis pulmonar, enfermedad inflamatoria del intestino, piel esclerótica y queloides, desmoplasia y placas ateroscleróticas (Abraham y col. (2000) J Biol Chem 275:1522015225; Dammeier y col. (1998) Int J Biochem Cell Biol 30:909-922; diMola y col. (1999) Ann Surg 230 (1) :63-71; Igarashi y col. (1996) J Invest Dermatol 106:729-733; Ito y col. (1998) Kidney Int 53:853-861; Williams y col. (2000) J Hepatol 32:754-761; Clarkson y col. (1999) Curr Opin Nephrol Hypertens 8:543-548; Hinton y col. (2002) Eye 16:422428; Gupta y col. (2000) Kidney Int 58:1389-1399; Riser y col. (2000) J Am Soc Nephrol 11:25-38) .

El CTGF también está regulado por incremento en glomerulonefritis, nefropatía por IgA, glomeruloesclerosis focal y segmental y nefropatía diabética (véase, por ejemplo, Riser y col. (2000) J Am Soc Nephrol 11:25-38) . Un aumento en el número de células que expresa CTGF también se observa en sitios de lesión tubulointersticial crónica, y los niveles de CTGF guardan relación con el grado de lesión (Ito y col. (1998) Kidney Int 53:853-861) . Además, la expresión de CTGF es elevada en los glomérulos y el tubulointersticio en una variedad de enfermedades renales en asociación con cicatrización y esclerosis del parénquima renal. Niveles elevados de CTGF también se han asociado a fibrosis hepática, infarto de miocardio y fibrosis pulmonar. Por ejemplo, en pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (FPI) , el CTGF está fuertemente regulado por incremento en biopsias y células de lavado broncoalveolar (Ujike y col. (2000) Biochem Biophys Res Commun 277:448-454; Abou-Shady y col. (2000) Liver 20:296-304; Williams y col. (2000) J Hepatol 32:754-761; Ohnishi y col. (1998) J Mol Cell Cardiol 30:2411-22; Lasky y col. (1998) Am J Physiol 275: L365-371; Pan y col. (2001) Eur Respir J 17:1220-1227; y Allen y col. (1999) Am J Respir Cell Mol Biol 21:693-700) . Por tanto, el CTGF representa una diana terapéutica válida en trastornos tales como aquellos descritos anteriormente.

Se ha establecido la asociación de CTGF con diversos aspectos de estos trastornos; y se han descrito procedimientos para tratar trastornos mediante la modulación de CTGF (véanse, por ejemplo, Grotendorst y Bradham, patente de EE.UU. nº 5.783.187; publicación internacional nº WO 00/13706; y publicación internacional nº WO 03/049773) . La modulación de factores de crecimiento, citocinas y receptores de la superficie celular puede llevarse a cabo usando anticuerpos monoclonales, y se han autorizado varios anticuerpos monoclonales terapéuticos o están en desarrollo (véanse, por ejemplo, infliximab (Remicade; Maini y col. (1998) Arthritis Rheum 41:1552-1563; Targan y col. (1997) N Engl J Med 337:1029-1035) ; basiliximab (Simulect) y daclizumab (Zenapax) (Bumgardner y col. (2001) Transplantation 72:839-845; Kovarik y col. (1999) Transplantation 68:1288-1294) ; y trastuzumab (Herceptin; Baselga (2001) Ann Oncol 12 Suppl 1:S49-55) . )

Se han generado anticuerpos contra CTGF y han demostrado ser eficaces in vivo en, por ejemplo, la inhibición de angiogénesis (véanse, por ejemplo, Grotendorst y Bradham, patente de EE.UU. nº 5.408.040; publicación internacional nº WO 99/07407; y Shimo y col (2001) Oncology 61:315-322) . Además, la naturaleza moduladora de CTGF parece distinguir dominios que participan en actividades biológicas específicas. Por ejemplo, se ha mostrado que la mitad del extremo N de CTGF estimula la diferenciación celular y la producción de ECM, mientras que la mitad del extremo C estimula la proliferación celular (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales nº WO 00/35936 y WO 00/35939; y Brigstock y Harding, patente de EE.UU. nº 5.876.70) . Esto demuestra... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o porción del mismo que se une específicamente a al menos una parte de una región sobre CTGF humano definida como los aminoácidos 143 a 154 de SEC ID Nº : 2 o a una región ortóloga sobre CTGF derivada de otras especies.

2. El anticuerpo de cualquier reivindicación precedente, en el que la afinidad del anticuerpo por CTGF es aproximadamente 10-9 M.

3. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo tiene la misma especificidad que un anticuerpo producido por la línea celular identificada por el nº de acceso de ATCC PTA-6006.

4. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo se produce por la línea celular identificada por el nº de acceso de ATCC PTA-6006.

5. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la porción es un fragmento Fab, F (ab) 2 o Fv.

6. Un anticuerpo que se une específicamente a al menos una parte de una región sobre CTGF humano definida como los aminoácidos 143 a 154 de SEC ID Nº : 2 o a una región ortóloga sobre CTGF derivada de otras especies, que comprende un primer polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende SEC ID Nº : 14;

(b) una secuencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende el dominio variable de SEC ID Nº : 14; o

(c) una variante conservativa de (a) o (b) ; y un segundo polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(d) una secuencia de la cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende SEC ID Nº : 20;

(e) una secuencia de la cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende el dominio variable de SEC ID Nº : 20; o

(f) una variante conservativa de (d) , o (e) .

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que el dominio variable del primer polipéptido comprende un dominio variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina como se define en los aminoácidos 1 a 167 de SEC ID Nº : 14.

8. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que el dominio variable del segundo polipéptido comprende un dominio variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina como se define en los aminoácidos 1 a 136 de SEC ID Nº : 20.

9. Un anticuerpo según la reivindicación 6 que comprende una cadena pesada de la inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEC ID Nº : 14 y una cadena ligera de la inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEC ID Nº : 20.

10. El anticuerpo de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo puede neutralizar estimulación inducida por CTGF de migración celular.

11. El anticuerpo de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo es para su uso en reducir fibrosis en un sujeto.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que la fibrosis se produce dentro de un tejido seleccionado del grupo que consiste en tejido epitelial, endotelial y conjuntivo.

13. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que la fibrosis se produce dentro de un órgano seleccionado del grupo que consiste en riñón, pulmón, hígado, corazón y piel.

14. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo monocatenario.

15. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo humanizado.

16. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo quimérico.

17. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo multivalente.

18. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

19. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo está glicosilado.

20. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que el anticuerpo está no glicosilado.

21. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo está conjugado con

un agente citotóxico o enzima.

22. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo está detectablemente marcado.

23. El anticuerpo de la reivindicación 22, en el que la marca detectable es una enzima, resto fluorescente, resto quimioluminiscente, biotina, avidina o radioisótopo.

24. Un anticuerpo quimérico según la reivindicación 1 que comprende una región variable derivada de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 y una región constante derivada de otra fuente.

25. El anticuerpo quimérico de la reivindicación 24, en el que la región constante se deriva de una región constante de una inmunoglobulina humana.

26. Una formulación farmacéutica de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

27. La formulación farmacéutica de la reivindicación 26 que comprende además un segundo agente terapéutico.

28. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 para su uso en medicina.

29. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 para administración a un sujeto predispuesto a o diagnosticado con hipertensión, hiperglucemia, diabetes, infarto de miocardio, artritis e inflamación local o sistémica.

30. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 para su uso en el tratamiento, o la prevención, de un trastorno proliferativo celular.

31. El anticuerpo de la reivindicación 30, en el que el trastorno proliferativo celular es angiogénesis, aterosclerosis, glaucoma o cáncer.

32. El anticuerpo de la reivindicación 31, en el que dicho cáncer incluye leucemia linfoblástica aguda, dermatofibromas, cáncer de mama, carcinoma de mama, desmoplasia, angiolipoma, angioleiomioma, cáncer desmoplásico, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer gastrointestinal o cáncer de hígado.

33. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 para su uso en el tratamiento de o la prevención de un trastorno fibrótico.

34. El anticuerpo de la reivindicación 33, en el que el trastorno fibrótico es fibrosis pulmonar idiopática, nefropatía diabética, retinopatía diabética, osteoartritis, esclerodermia, insuficiencia cardíaca crónica o hígado cirrótico.

35. Un medicamento que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 para tratar un sujeto que tiene un trastorno seleccionado del grupo que consiste en fibrosis pulmonar idiopática, nefropatía diabética, insuficiencia cardíaca crónica e hígado cirrótico.

36. Un medicamento que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 para tratar un sujeto predispuesto a un trastorno debido a una afección seleccionada del grupo que consiste en hipertensión, diabetes, infarto de miocardio, artritis e inflamación local o sistémica.

37. Un par de secuencias de polinucleótidos que comprende una primera secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de polinucleótidos que codifica SEC ID Nº : 14;

(b) una secuencia de polinucleótidos que codifica del aminoácido 1 al aminoácido 167 de SEC ID Nº : 14;

(c) SEC ID Nº : 13; y

(d) nucleótido 1 al nucleótido 501 de SEQ ID: 13;

y una segunda secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a') una secuencia de polinucleótidos que codifica SEC ID Nº : 20; (b') una secuencia de polinucleótidos que codifica del aminoácido 1 al aminoácido 136 de SEC ID Nº : 20; (c') SEC ID Nº : 19; y (d') nucleótido 1 al nucleótido 408 de SEC ID Nº : 19.

38. Un par de polinucleótidos recombinantes que comprende un primer polinucleótido recombinante que comprende la primera secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 37 operativamente ligada a una secuencia de vector que contiene secuencias de control de la replicación y la transcripción; y un segundo polinucleótido recombinante que comprende la segunda secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 37 operativamente ligada a una secuencia de vector que contiene secuencias de control de la replicación y la transcripción.

39. Los polinucleótidos recombinantes de la reivindicación 38, en los que el primer polinucleótido codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 14 y el segundo polinucleótido codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 20.

40. Los polinucleótidos recombinantes de la reivindicación 39, en los que el primer polinucleótido comprende SEC ID 5 Nº : 13 y el segundo polinucleótido comprende SEC ID Nº : 19.

41. Una célula huésped transfectada con los polinucleótidos recombinantes de la reivindicación 38.

42. Una célula huésped que comprende una célula cotransfectada con un polinucleótido que codifica SEC ID Nº : 14 y un polinucleótido que codifica SEC ID Nº : 20, y que produce un anticuerpo funcional con las mismas características que el anticuerpo producido por la línea celular identificada por el nº de acceso de ATCC PTA-6006.

43. La célula huésped de la reivindicación 42, en la que la célula huésped es la línea celular identificada por el nº de acceso de ATCC PTA-6006.