ENSAYO DE ACTIVIDAD DE LA PROLIL HIDROXILASA DE HIF.

Un procedimiento para medir la actividad de una enzima EGLN, comprendiendo el procedimiento

(a) combinar una enzima EGLN con 2-oxoglutarato,

un agente reductor y un péptido en condiciones adecuadas para la actividad de la enzima EGLN, y

(b) medir la actividad de la enzima, en el que el péptido comprende la secuencia X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-Z-X 6, en la que X1, X2, y X3 se seleccionan independientemente entre cualquier aminoácido; X4 se selecciona entre isoleucina, valina, arginina, fenilalanina, tirosina, metionina, treonina, lisina, triptófano, cisteína, asparagina, histidina, serina, alanina, glicina, glutamato, glutamina, o leucina; X5 se selecciona entre treonina, serina, lisina, glutamina, metionina, isoleucina, arginina, histidina, glutamato, fenilalanina, cisteína, leucina, o alanina; X 6 se selecciona entre fenilalanina o tirosina; y Z es un análogo de prolina que no es susceptible de hidroxilación mediante la prolil hidroxilasa de HIF

Ensayo de actividad de la prolil hidroxilasa de HIF.

Campo de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para medir la actividad EGLN, y el uso de los procedimientos para identificar agentes que modulan la actividad EGLN.

Antecedentes

Las enzimas 2-oxoglutarato dioxigenasa son responsables de diversos procesos fisiológicos asociados con el mantenimiento celular normal y la respuesta celular los cambios en el entorno y al estrés. Las 2-oxoglutarato dioxigenasas son oxigenasas no dependientes de hemo-Fe(U) que modifican, por ejemplo, mediante hidroxilación, diversos sustratos. Además del hierro, las 2-oxoglutarato dioxigenasas requieren oxígeno, 2-oxoglutarato, y ácido ascórbico para su actividad. Algunos de los miembros de la familia mejor estudiados incluyen las enzimas lisina hidroxilasa que modifican el colágeno (EC 1.14.11.4), la prolil 3-hidroxilasa (EC 1.14.11.7) y la subunidad a de la prolil 4-hidroxilasa (P4H; EC 1.14.11.2). (Véanse, por ejemplo, Majamaa y col. (1985) Biochem J 229:127-133; Myllyharju y Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180.).

Todas las enzimas 2-oxoglutarato dioxigenasa utilizan un mecanismo catalítico común que implica la coordinación del 2-oxoglutarato y el dioxígeno con el hierro unido a la enzima. El oxígeno se escinde posteriormente, y un átomo de oxígeno se transfiere al 2-oxoglutarato para producir dióxido de carbono y succinato. El restante átomo de oxígeno unido al Fe modifica a continuación un segundo sustrato; en el caso de P4H, un resto de prolina que reside dentro de una secuencia particular de aminoácidos del marco de colágeno se oxida a hidroxiprolina. De esta manera, las enzimas de esta familia requieren hierro, usan 2-oxoglutarato y dioxígeno como sustratos, y producen succinato y dióxido de carbono como productos. El sustrato adicional utilizado por cada enzima difiere entre los miembros de la familia, y distingue por tanto los diversos miembros de la familia y proporciona un contexto único para cada reacción catalizada. Las enzimas requieren también ácido ascórbico como cofactor para evitar la inactivación de la enzima.

Egl-9 es el miembro fundador de un grupo nuevamente descrito de 2-oxoglutarato dioxigenasas (Aravind y Koonin (2001) Genome Biol 2: RESEARCH0007; Taylor (Taylor (2001) Gene 275: 125-132.). Egl-9, originalmente identificado como un producto génico necesario para la puesta de huevos en Caenorhabditis elegans, se encontró también que era necesario para la parálisis muscular inducida por Pseudomonas aeruginosa en el nematodo. Adicionalmente, se identificó un homólogo de rata, SM-20, expresado en tejidos y células derivadas de músculo (liso, esquelético, y cardíaco) y nervio. (Darby y col. (1999) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 96: 15202-15207; véanse también, Wax y col. (1994) J Biol Chem 269(17): 13041-13047; Wax y col. (1996) Lab Invest 74(4): 797-808.). De manera interesante, se han identificado también homólogos de Egl-9 en bacterias, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa y Vibrio cholera, así como en Drosophila, sugiriendo la conservación evolucionaria del grupo de enzimas Egl-9 (Véase, por ejemplo, Aravind y Koonin, véase más arriba). Se ha expandido adicionalmente la familia Egl-9 para incluir los homólogos humanos y de ratón, identificados como EGLN1, EGLN2, y EGLN3. (Taylor, más arriba.).

Aunque no se conocía el sustrato de la familia EGLN, estas enzimas se asociaron con la regulación de la supervivencia y el crecimiento celular en respuesta a diversos factores. (Véanse, por ejemplo, Lipscomb y col. (1999) J Neurochem 73: 429-432; Moschella y col. (1999) Gene Expr 8: 59-66; y Lipscomb y col. (2001) J Biol Chem 276: 5085-5092.). El reconocimiento del sustrato de EGLN como la subunidad alfa del factor inducible por hipoxia (HIFa) ha implicado a esta familia de enzimas en la respuesta celular respecto del oxígeno. (Epstein y col. (2001) Cell 107: 43-54; Bruick y McKnight (2001) Science 294: 1337-1340.). HIF, un factor de transcripción que activa la transcripción génica en condiciones de oxígeno bajo, es un heterodímero compuesto por una subunidad beta única (HIFß/ARNT) y una familia de subunidades HIFa. Todas las células parecen expresar HIF-1a e HIF-1ß constitutivamente; sin embargo, en condiciones normóxicas, la subunidad HIFa está hidroxilada por EGLN y se degrada posteriormente mediante el sistema de la ubiquitina ligasa. En condiciones de oxígeno bajo, la subunidad HIFa es estable y capaz de acumularse en el interior de la células, en la que dimeriza con HIFß, se transloca en el núcleo, e inicia la transcripción génica. Los genes específicos transcritos por el factor de transcripción de HIF proporcionan respuestas compensatorias locales y sistémicas que facilitan la supervivencia celular y la recuperación metabólica durante los episodios hipóxicos.

Diversas publicaciones informan de la investigación del marco del péptido en el interior del sustrato de HIFa que es esencial para la sensibilidad del oxígeno. Las investigaciones se centraron originalmente en la región interna de HIFa necesaria para la interacción con pVHL. (Véanse, por ejemplo., Huang y col. (1998) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 95: 7987-7992; Tanimoto y col. (2000) EMBO J 19: 4298-4309; y Poellinger y col., Publicación Internacional Nº. WO 02/12326.). Aunque estas investigaciones identificaron un motivo básico necesario para el reconocimiento de HIFa por pVHL, no determinan las necesidades de la secuencia de aminoácidos para la interacción de HIFa con EGLN. Más recientemente, las investigaciones se centraron en la región en el interior de HIFa necesaria para la hidroxilación por EGLN (véanse, por ejemplo., Hirsila y col. (2003) J Biol Chem 278: 30772-30780; y Huang y coll. (2002) J Biol Chem 277: 39792-39800.). Aunque está región solapa con la región que interactúa con pVHL, el marco específicos de los aminoácidos parece mostrar diferentes requerimientos estructurales.

Huang y col (2002) J Biol Chem 277(42): 39792-800 dan a conocer los determinantes de las secuencias en HIF-1a para la hidroxilación mediante las prolil hidroxilasas PHD1, PHD2, y PHD3.

El documento WO 03/049686 da a conocer un ensayo de cribado para compuestos que inhiben la actividad de la prolil hidroxilasa específica de HIF y estabilizan por tanto HIFa. El ensayo implica la medida de la hidroxilación de un péptido HIF, tal como [metoxi-cumarina]-DLDLEALAPYIPADDDFQL-amida.

Oehme y col (2004) Anal Biochem 330(1): 74-80 dan a conocer un ensayo no radioactivo en placas de 96 pocillos para la detección de la actividad de la prolil hidroxilasa del factor inducible por hipoxia.

El documento 02/074981 se refiere a un tipo de hidroxilasas y variantes y fragmentos de las mismas que tienen actividad de hidroxilación de HIF. Se dice que los polipéptidos tienen en concreto actividad prolil hidroxilasa. Un procedimiento de ensayo vigila la interacción de la hidroxilasa de HIF con un sustrato.

Sería ventajoso un procedimiento para medir la actividad de EGLN, especialmente en un formato de alto rendimiento, para el estudio de la cinética de la enzima y la selección y el diseño de los inhibidores de la enzima. Adicionalmente, la identificación de los motivos de reconocimiento del sustrato que muestren preferencia por un miembro de la familia EGLN en relación con otros miembros de la familia proporcionaría una nueva percepción en el diseño del inhibidor para dirigir a los miembros individuales de la familia. La presente invención proporciona dicho procedimiento, y define sustratos que muestran selectividad en la interacción con diversos medios de la familia EGLN. La presente invención proporciona también el uso de procedimientos para identificar agentes que modulan la actividad de una enzima EGLN.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para medir la actividad de una enzima EGLN. En un aspecto, la invención proporciona el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1. En diversas formas de realización, el 2-oxoglutarato se proporciona en un intervalo de entre aproximadamente 0,1 a 100 µM, por ejemplo, entre 10 y 100 µM; y se puede suministrar en cualquier forma adecuada que incluya, por ejemplo, una sal.

En otro aspecto, la invención proporciona el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2.

En diversas formas de realización, la enzima EGLN usada en los procedimientos de la invención comprende la secuencia de la SEC DE ID Nº: 1, en otras formas de realización, la enzima EGLN comprende la secuencia de la SEC de Nº: 3. En forma de realización particulares, la enzima...

1. Un procedimiento para medir la actividad de una enzima EGLN, comprendiendo el procedimiento

(a)        combinar una enzima EGLN con 2-oxoglutarato, un agente reductor y un péptido en condiciones adecuadas para la actividad de la enzima EGLN, y

(b)        medir la actividad de la enzima,

en el que el péptido comprende la secuencia X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-Z-X₆, en la que

X₁, X₂, y X₃ se seleccionan independientemente entre cualquier aminoácido;

X₄ se selecciona entre isoleucina, valina, arginina, fenilalanina, tirosina, metionina, treonina, lisina, triptófano, cisteína, asparagina, histidina, serina, alanina, glicina, glutamato, glutamina, o leucina;

X₅ se selecciona entre treonina, serina, lisina, glutamina, metionina, isoleucina, arginina, histidina, glutamato, fenilalanina, cisteína, leucina, o alanina;

X₆ se selecciona entre fenilalanina o tirosina; y

Z es un análogo de prolina que no es susceptible de hidroxilación mediante la prolil hidroxilasa de HIF.

2. Un procedimiento para identificar un agente que modula la actividad de una enzima EGLN, comprendiendo el procedimiento

(a)        combinar una enzima EGLN con un agente de ensayo, 2-oxoglutarato, un agente reductor y un péptido en condiciones adecuadas, en ausencia del agente, para la actividad del enzima EGLN,

       en el que el péptido comprende la secuencia X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-Z-X₆, en la que

       X₁, X₂ X₃ X₄ se seleccionan independientemente entre cualquier aminoácido;

       X₄ se selecciona entre isoleucina, valina, arginina, fenilalanina, tirosina, metionina, treonina, lisina, triptófano, cisteína, asparagina, histidina, serina, alanina, glicina, glutamato, glutamina, o leucina;

       X₅ se selecciona entre treonina, serina, lisina, glutamina, metionina, isoleucina, arginina, histidina, glutamato, fenilalanina, cisteína, leucina, o alanina,

       X₆ se selecciona entre fenilalanina o tirosina, y

       Z es un análogo de prolina que no es susceptible de hidroxilación mediante la prolil hidroxilasa de HIF

(b)        medir la actividad de la enzima y

(c)        comparar la actividad de la enzima en presencia del agente con la actividad de la enzima en ausencia del agente, en el que un cambio en la actividad de la enzima en presencia del agente respecto de la actividad de la enzima en ausencia del agente es indicativo de un agente que modula la actividad de EGLN.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente reductor se selecciona entre el grupo constituido por ascorbato y ferrocianuro de potasio.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de combinación comprende adicionalmente hierro.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enzima EGLN comprende la secuencia de la SEC DE ID Nº: 3.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la enzima EGLN comprende la secuencia de la SEC DE ID Nº: 2.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la enzima EGLN se selecciona entre el grupo constituido por EGLN1, EGLN2, EGLN3, y los fragmentos activos de EGLN1, EGLN2, y EGLN3.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el péptido se selecciona entre el grupo constituido por las SEC DE ID N^os: 62-78.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enzima EGLN se selecciona entre el grupo que comprende EGLN1, un fragmento activo de EGLN1, EGLN2, y un fragmento activo de EGLN2; y el péptido comprende la secuencia X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-Z-X₆, en la que

X₁ se selecciona entre tirosina, triptófano, metionina, isoleucina, fenilalanina, aspartato, alanina, glutamato, cisteína, prolina, glicina, y leucina;

X₂ y X₃ se seleccionan independientemente entre cualquier aminoácido:

X₄ se selecciona entre isoleucina, valina, arginina, fenilalanina, tirosina, metionina, treonina, lisina, triptófano, cisteína, asparagina, histidina, serina, alanina, glicina, glutamato, glutamina, o leucina;

X₅ se selecciona entre treonina, serina, lisina, glutamina, metionina, o alanina;

X₆ se selecciona entre fenilalanina o tirosina; y

Z es un análogo de prolina que no es susceptible de hidroxilación mediante prolil hidroxilasa de HIF.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el péptido se selecciona entre el grupo constituido por las SEC DE ID N^os: 62 y 63.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enzima EGLN es EGLN3 o un fragmento activo de EGLN3.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el péptido se selecciona entre el grupo constituido por las SEC DE ID N^os: 62, 63, 69 y 72.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que Z es acetidina-2-carboxilato.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el péptido se selecciona entre el grupo constituido por las SEC DE ID N^os: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 76, 77, y 78.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que Z es 3,4-deshidroprolina.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el péptido es la SEC DE ID Nº: 62.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que Z es b-tioprolina.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el péptido es la SEC DE ID Nº: 72.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la medida de la actividad de EGLN comprende medir el dióxido de carbono producido por la reacción, en el que la cantidad de dióxido de carbono producido es directamente proporcional a la actividad de la enzima EGLN.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 13 a 18, en el que la medida de la actividad de EGLN comprende medir la conversión del agente reductor en su forma oxidada durante la reacción, en el que la cantidad de agente reductor que se oxida es directamente proporcional a la actividad de la enzima EGLN.

21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el péptido tiene al menos 20 aminoácidos de longitud.

22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Z se selecciona entre los isómeros L y D de acetidina-2-carboxilato, 3,4-deshidroprolina, b-tioprolina y 2,3-deshidroprolina.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que Z es un isómero L.

24. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que Z se seleccionas entre trans-4-hidroxiprolina, ácido acetidina-3-carboxílico y D-prolina.