Un método de preparación de un tejido para xenotrasplante, que comprende las etapas de:

(i) incubar el tejido con una enzima que tiene actividad a-galactosidasa, escindiendo de ese modo los residuos de galactosa terminales unidos en a1-3 inmunodominantes del tejido, y (ii) aislar el tejido de la enzima y los residuos de galactosa inmunodominantes escindidos enzimáticamente, haciendo por ello que el tejido sea adecuado para xenotrasplante;

en el que la enzima comprende al menos 10 aminoácidos en la siguiente secuencia numerada consiguientemente cuando se alinea con SEQ ID NO:2:

M en el residuo ; G en el residuo 47; G en el residuo 84; Y en el residuo 86;

Y en el residuo 99; N en el residuo 102; K en el residuo 114; T en el residuo 127;

G en el residuo 130; G en el residuo 132; G en el residuo 139;

N en el residuo 156; D en el residuo 160; P en el residuo 164;

G en el residuo 205; R en el residuo 277; R en el residuo 281; F en el residuo 287;

G en el residuo 308; Q en el residuo 312; I en el residuo 317; R en el residuo 333;

D en el residuo 340; G en el residuo 346; G en el residuo 349; G en el residuo 360; D en el residuo 363; D en el residuo 364;

N en el residuo 367; H en el residuo 369; G en el residuo 370; T en el residuo 371;

G en el residuo 396; E en el residuo 462; N en el residuo 463; T en el residuo 465;

T en el residuo 467; P en el residuo 468; R en el residuo 483; G en el residuo 484;

L en el residuo 486; T en el residuo 489; N en el residuo 498; I en el residuo 508;

D en el residuo 513; W en el residuo 517; E en el residuo 519; G en el residuo 521;

D en el residuo 525; I en el residuo 528; N en el residuo 531; F en el residuo 533;

I en el residuo 549; P en el residuo 553; I en el residuo 573; A en el residuo 590; G en el residuo 595;

N en el residuo 601; e I en el residuo 629;

y en el que la enzima tiene una identidad de al menos el 20% con SEQ ID NO:2 cuando se alinea con SEQ ID NO:2, y en el que la enzima tiene actividad alfa-galactosidasa.

α-Galactosidasas novedosas

Esta invención se refiere a una familia novedosa de polipéptidos que tienen actividades α-galactosidasa, que demuestran especificidades de sustrato únicas y propiedades cinéticas superiores, que se usan para la eliminación de los monosacáridos inmunodominantes en tejidos y productos sanguíneos. Específicamente, esta invención proporciona una familia novedosa de α3 glicosidasas, usadas para la eliminación enzimática de antígenos de tipo B de productos sanguíneos reactivos para el grupo sanguíneo B y AB, y el antígeno Galili de tejidos animales no

humanos, convirtiendo de ese modo éstos en tejidos y células no inmunogénicos y adecuados para trasplante.

Antecedentes de la invención

Tal como se usa en el presente documento, el término “productos sanguíneos” incluye sangre completa y 15 componentes celulares derivados de la sangre, incluyendo eritrocitos (glóbulos rojos) y plaquetas.

Hay más de treinta sistemas de grupos sanguíneos (o tipos) , uno de los más importantes de los cuales es el sistema ABO. El sistema se basa en la presencia o ausencia de antígenos A y/o B. Estos antígenos se encuentran en la superficie de eritrocitos y plaquetas así como en la superficie de células endoteliales y la mayor parte de células

epiteliales. El principal producto sanguíneo usado para la transfusión son los eritrocitos, que son glóbulos rojos que contienen hemoglobina, cuya principal función es el transporte de oxígeno. La sangre del grupo A contiene antígeno A en sus eritrocitos. De manera similar, la sangre del grupo B contiene antígeno B en sus eritrocitos. La sangre del grupo AB contiene ambos antígenos, y la sangre del grupo O no contiene ningún antígeno.

Las estructuras de grupo sanguíneo son glicoproteínas y glicolípidos y se ha realizado un trabajo considerable para identificar las estructuras específicas que constituyen los determinantes o antígeno A y B. La especificidad del grupo sanguíneo ABH se determina por la naturaleza y el enlace de los monosacáridos en los extremos de las cadenas de hidratos de carbono. Las cadenas de hidratos de carbono están unidas a una estructura principal de péptido (glicoproteína) o lípido (glicoesfingolípido) , que están unidos a la membrana celular de las células. El monosacárido

inmunodominante que determina la especificidad de tipo A es una N-acetilgalactosamina (GalNAc) unida en α1-3, mientras que el monosacárido correspondiente de la especificidad de tipo B es una galactosa (Gal) unida en α1-3. Las células de tipo O carecen de cualquiera de estos monosacáridos en los extremos terminales de las cadenas de oligosacáridos, que en su lugar están terminadas con residuos de fucosa (Fuc) unidos en α1-2.

Se encuentra una gran diversidad de estructuras de hidratos de carbono del grupo sanguíneo ABH debido a variaciones estructurales en las cadenas de oligosacáridos que portan sacáridos inmunodominantes ABH. La tabla 1 enumera estructuras notificadas en el hombre y aquéllas que se han encontrado en glóbulos rojos o en extractos de sangre. Para una revisión, véase, Clausen & Hakomori, Vox Sang 56 (1) : 1-20, 1989. Los glóbulos rojos contienen antígenos ABH en glicoproteínas y glicoesfingolípidos N-unidos, mientras que se cree generalmente que los glicanos

O-unidos en glicoproteínas de eritrocitos, principalmente glicoforinas, están terminadas por ácido siálico y no con antígenos ABH. Los glicoesfingolípidos de cadena tipo 1 no son productos endógenos de glóbulos rojos, sino que en su lugar se absorben del plasma.

Tabla I: 45 Determinantes inmunorreactivos del grupo histosanguíneo ABH de células humanas1

1Adaptado de Clausen y Hakomori, Vox Sang 56 (1) : 1-20, 1989. Designaciones: “?” indica posibles estructuras de glicolípido que no se han notificado hasta la fecha.

El grupo sanguíneo A y B existe en varios subtipos. Los subtipos del grupo sanguíneo A son los más frecuentes, y hay tres subtipos principales reconocidos del tipo sanguíneo A. Estos subtipos se conocen como A1, A intermedio (Aint) y A2. Hay diferencias tanto cuantitativas como cualitativas que distinguen estos tres subtipos. Cuantitativamente, los eritrocitos A1 tienen más sitios A antigénicos, es decir, residuos de N-acetilgalactosamina terminales, que eritrocitos Aint que a su vez tienen más sitios A antigénicos que eritrocitos A2. Cualitativamente, los eritrocitos A1 tienen una estructura A doblemente repetida en un subconjunto de glicoesfingolipidos, mientras que células A2 tienen una estructura H en una estructura A interna en un subconjunto similar de glicolípidos (Clausen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (4) : 1199-203, 1985, Clausen et al., J. Biol. Chem. 261 (3) : 1380-7, 1986) . Estas diferencias entre los subtipos A1 y A débil se piensa se refieren a diferencias en las propiedades cinéticas de variantes de isoenzimas del grupo sanguíneo A responsables de la formación de antígenos A (Clausen et al., J. Biol.

Chem. 261 (3) : 1388-92, 1986) . Se cree que las diferencias de subtipos del grupo B son únicamente de naturaleza cuantitativa.

La sangre del grupo A contiene anticuerpos frente al antígeno B. A la inversa, la sangre del grupo B contiene anticuerpos frente al antígeno A. La sangre del grupo AB no tiene ningún anticuerpo, y la sangre del grupo O tiene ambos. Se cree que los anticuerpos frente a estos y otros antígenos de grupo sanguíneo definidos por hidratos de carbono se producen por la exposición continua a un organismo microbiano que porta estructuras de hidratos de carbono relacionadas. Un individuo cuya sangre contiene cualquiera (o ambos) de los anticuerpos anti-A o anti-B no puede recibir una transfusión de sangre que contiene el/los correspondiente (s) antígeno (s) incompatible (s) . Si un individuo recibe una transfusión de sangre de un grupo incompatible, los anticuerpos del receptor de la transfusión

de sangre recubren los glóbulos rojos del grupo incompatible transfundido y provocan que los glóbulos rojos transfundidos se aglutinen, o se peguen entre sí. Puede resultar de lo mismo reacciones frente a la transfusión y/o hemólisis (la destrucción de los glóbulos rojos) .

Con el fin de evitar reacciones graves frente a la transfusión debido a la presencia de anticuerpos frente a los antígenos del grupo sanguíneo A y B, el grupo sanguíneo del donante y el receptor se igualan antes de las transfusiones de sangre mediante métodos de tipificación. Por ejemplo, un receptor con sangre de tipo A puede... [Seguir leyendo]

1. Un método de preparación de un tejido para xenotrasplante, que comprende las etapas de:

(i) incubar el tejido con una enzima que tiene actividad α-galactosidasa, escindiendo de ese modo los residuos de galactosa terminales unidos en α1-3 inmunodominantes del tejido, y

(ii) aislar el tejido de la enzima y los residuos de galactosa inmunodominantes escindidos enzimáticamente, haciendo por ello que el tejido sea adecuado para xenotrasplante; en el que la enzima comprende al menos 10 aminoácidos en la siguiente secuencia numerada consiguientemente cuando se alinea con SEQ ID NO:2: M en el residuo 10; G en el residuo 47; G en el residuo 84; Y en el residuo 86; Y en el residuo 99; N en el residuo 102; K en el residuo 114; T en el residuo 127; G en el residuo 130; G en el residuo 132; G en el residuo 139; N en el residuo 156; D en el residuo 160; P en el residuo 164; G en el residuo 205; R en el residuo 277; R en el residuo 281; F en el residuo 287; G en el residuo 308; Q en el residuo 312; I en el residuo 317; R en el residuo 333; D en el residuo 340; G en el residuo 346; G en el residuo 349; G en el residuo 360; D en el residuo 363; D en el residuo 364; N en el residuo 367; H en el residuo 369; G en el residuo 370; T en el residuo 371; G en el residuo 396; E en el residuo 462; N en el residuo 463; T en el residuo 465; T en el residuo 467; P en el residuo 468; R en el residuo 483; G en el residuo 484; L en el residuo 486; T en el residuo 489; N en el residuo 498; I en el residuo 508; D en el residuo 513; W en el residuo 517; E en el residuo 519; G en el residuo 521; D en el residuo 525; I en el residuo 528; N en el residuo 531; F en el residuo 533; I en el residuo 549; P en el residuo 553; I en el residuo 573; A en el residuo 590; G en el residuo 595; N en el residuo 601; e I en el residuo 629; y en el que la enzima tiene una identidad de al menos el 20% con SEQ ID NO:2 cuando se alinea con SEQ ID NO:2, y en el que la enzima tiene actividad alfa-galactosidasa.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la enzima comprende nueve aminoácidos contiguos que tienen la secuencia DD (P/A) (V/I) N (V/I) HGT (SEQ ID NO:10) .

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la enzima comprende veintiún aminoácidos contiguos que tienen la secuencia: DXXXW (Y/F) E (S/T) GXXXD (L/V) (L/T) I (K/R) XNXF (SEQ ID NO:11) , en la que X puede ser cualquier aminoácido.

4. El método según la reivindicación 1-3, en el que la enzima comprende una secuencia especificada por SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, y en el que la enzima presenta actividad alfa galactosidasa con especificidad por sustratos ramificados, especificidad por sustratos lineales

o ambas y un óptimo de pH neutro.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el tejido es tejido conjuntivo.

6. El método según la reivindicación 5, en el que el tejido conjuntivo es un ligamento.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el tejido es un órgano.

8. El método según la reivindicación 7, en el que el órgano se selecciona del grupo que consiste en: hígado, riñón y

corazón.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el tejido es del grupo que consiste en: colágeno inyectable no inmunogénico; xenoinjertos óseos; tejido blando y xenoinjertos de tejido blando reducido en proteoglicano; válvulas cardiacas de xenoinjerto; xenoinjertos de menisco; y matrices de tejido.