Nuevas alfa-galactosidasas.

Un procedimiento de preparar de un tejido para xenotrasplante,

que comprende las etapas de:

(i) incubar el tejido con una enzima que tiene actividad alfa-5 galactosidasa,

(ii) por lo tanto escindir los residuos de galactosa terminales alfa-1-3 unidos inmunodominantes del tejido y aislar eltejido de la enzima y los residuos de galactosa inmunodominantes escindidos enzimáticamente, por lo tanto volviendoal tejido adecuado para xenotrasplante, en el que la enzima comprende al menos 10 aminoácidos en la siguientesecuencia numerados de acuerdo con ella cuando se alinean con SEC ID n.º: 2:

M en residuo 10; G en residuo 47; G en residuo 84; Y en residuo 86;

Y en residuo 99; N en residuo 102; K en residuo 114; T en residuo 127;

G en residuo 130; G en residuo 132; G en residuo 139; N en residuo 156;

D en residuo 160; P en residuo 164; G en residuo 205; R en residuo 277;

R en residuo 281; F en residuo 287; G en residuo 308; Q en residuo 312;

I en residuo 317; R en residuo 333; D en residuo 340; G en residuo 346;

G en residuo 349; G en residuo 360; D en residuo 363; D en residuo 364;

N en residuo 367; H, en residuo 369; G en residuo 370; T en residuo 371;

G en residuo 396; E en residuo 462; N en residuo 463; T en residuo 465;

T en residuo 467; P en residuo 468; R en residuo 483; G en residuo 484;

L en residuo 486; T en residuo 489; N en residuo 498; I en residuo 508;

D en residuo 513; W en residuo 517; E en residuo 519; G en residuo 521;

D en residuo 525; I en residuo 528; N en residuo 531; F en residuo 533;

I en residuo 549; P en residuo 553; I en residuo 573; A en residuo 590;

G en residuo 595; N en residuo 601; y I en residuo 629;

y en el que la enzima tiene al menos identidad del 20 % con la SEC ID N.º: 2 cuando se alinea con la SEC ID N.º: 2 yen el que la enzima tiene actividad [alfa]-galactosidasa;

(iii) aislar los eritrocitos convertidos de la etapa (ii) a partir de la enzima y los residuos de galactosa inmunodominantesescindidos enzimáticamente, escindiendo de este modo los epítopos B inmunodominantes en el eritrocito de grupo B ode grupo AB según se determina por serotipado o por ensayos de hemaglutinación.

Nuevas alfa-galactosidasas Esta invención se refiere a un grupo de polipéptidos que tienen actividades α-galactosidasa, demostrando especificidades de sustrato únicas y propiedades cinéticas superiores, que se usan para eliminación de monosacáridos inmunodominante en productos sanguíneos y tejidos. Específicamente esta invención proporciona una nueva familia de α3 glucosidasas, usada para la retirada enzimática de antígenos de tipo B a partir de los productos sanguíneos reactivos de los grupos B y AB y el antígeno Galili a partir de tejidos de origen animal no humano,

convirtiendo de este modo estos a células no inmunogénicas y a tejidos adecuados para trasplante.

Antecedentes de la invención Como se usa en el presente documento, el término "productos sanguíneos" incluye sangre completa y componentes 15 celulares derivados de sangre, incluyendo eritrocitos (glóbulos rojos) y plaquetas.

Hay más de treinta sistemas de grupos (o tipos) sanguíneos, de los que uno de los más importantes es el sistema AB0. Este sistema se basa en la presencia o ausencia de antígenos A y/o B. Estos antígenos se encuentran en la superficie de eritrocitos y plaquetas como así como en la superficie de células endoteliales y en la mayoría de las células epiteliales. El principal producto de la transfusión de sangre es eritrocitos, que son células sanguíneas rojas que contienen hemoglobina, de las que la función principal es el transporte de oxígeno. La sangre de grupo A contiene antígeno A en sus eritrocitos. De forma similar, la sangre de grupo B contiene antígeno B en sus eritrocitos. La sangre de grupo AB contiene ambos antígenos y la sangre de grupo 0 no contiene ningún antígeno.

Las estructuras del grupo sanguíneo son glucoproteínas o glucolípidos y se ha realizado un trabajo considerable para identificar las estructuras específicas que componen los determinantes o antígenos A y B. La especificidad del grupo sanguíneo ABH se determina por la naturaleza y unión de monosacáridos en los extremos de las cadenas de carbohidratos. Las cadenas de carbohidratos se unen a un armazón peptídico (glucoproteína) o lípido (glucoesfingolípido) , que están unidos a la membrana celular de las células. El monosacárido inmunodominante que determina especificidad de tipo A es una N-acetilgalactosamina α1-3 enlazada terminal (GalNAc) , mientras que el monosacárido correspondiente de especificidad de tipo B es una galactosa α1-3 enlazada (Gal) . Las células de tipo 0 carecen de cualquiera de estos monosacáridos en los extremos de cadenas oligosacarídicas, que en cambio están terminadas con residuos de fucosa (Fuc) α1-2 enlazada.

Se encuentran una gran diversidad de estructuras de carbohidratos ABH de grupos sanguíneos debido a variaciones estructurales en las cadenas oligosacarídicas que llevan sacáridos inmunodominantes de ABH. La tabla 1 enumera las estructuras descritas en el hombre y aquellas que se han encontrado en extractos de glóbulos rojos humanos o en extractos de sangre. Para una revisión, véase, Clausen y Hakomori, Vox Sang 56 (1) : 1-20, 1989) . Los glóbulos rojos contienen antígenos ABH de glicoproteínas N-ligadas y glucoesfingolípidos, mientras que se cree generalmente que los glucanos O-enlazados en glucoproteínas eritrocíticas, principalmente glucoforinas, están terminadas por ácido siálico y no con antígenos ABH. Los glucoesfingolípidos de cadena de tipo 1 no son productos endógenos de glóbulos rojos, pero se adsorben más a partir de plasma.

Tabla I:

Determinantes inmunorreactivos ABH de grupos sanguíneos de histocompatilidad de células humanas1

Nombre Estructura hapténica Tipo de glucoconjugado Hallado en los glóbulos rojos n.º

Tipo 1 de A, ALeG GalNAcα1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 1

Tipo 1 de A, ALeb GalNAcα1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-R 2 4 Fucα1 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 2

A tipo 2, A GalNAcα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 3

Tipo 2 de A, ALey GalNAcα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 3 Fucα1 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido? 4

Tipo 3 de A, O-ligado GalNAcα1-3Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr 2 Fucα1 O-ligado 5

A tipo 3, Repetitivo GalNAcα1-3Galβ1-3GalNAcα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 2 Fucα1 Fucα1 Glucolípido Glucolípido 6

Tipo 4 de A, Globo GalNAcα1-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-R 2 Fucα1 Glucolípido Glucolípido? 7

Tipo 4 de A, Ganglio GalNAcα1-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido 8

Tipo 1 de B, BLed Galα1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 9

Tipo 1 de B, BLeb Galα1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-R 2 4 Fucα1 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 10

Tipo 2 de B, B Galα1-3Gaβ1-4GlcNAcβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 11

Tipo 2 de B, BLey Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 3 Fucα1 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido? 12

Tipo 3 de B, O-ligado Galα1-3Galβ-3GalNAcα1-O-Ser/Thr 2 Fucα1 O-ligado 13

Tipo 4 de B, Globo Galα1-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-R 2 Fucα1 Glucolípido? Glucolípido? 14

Tipo 4 de B, Ganglio Galα1-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido? 15

Tipo 1 de H, Leα Galβ1-3GlcNAcβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 16

Tipo 1 de H, Leb Galβ1-3GlcNAcβ1-R 2 4 Fucα1 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 17

Tipo 2 de H, H Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 18

Tipo 2 de H, Ley Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 3 Fucα1 Fucα1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido? 19

Tipo 3 de H, O-ligado Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr 2 Fucα1 O-ligado 20

Tipo 3 de H, H-A Galβ1-3GalNAcα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 2 Fucα1 Fucα1 Glucolípido Glucolípido (A RBC) 21

Tipo 4 de H, Globo Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-R 2 Fucα1 Glucolípido Glucolípido 22

Tipo 4 de H, Ganglio Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-R 2 Fucα1 Glucolípido 23

Thomsen-Frie Denrich Tf, T Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr O-ligado O-ligado (+SA) 24

Gal-A, reactividad cruzada de T Galβ1-3GalNAcα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R 2 Fucα1 Glucolípido Glucolípido (A RBC) 25

Tn, reactividad cruzada de A GalNAcα1-O-Ser/Thr O-ligado O-ligado (+SA) 26

Adaptado de Clausen y Hakomori, Vox Sang 56 (1) : 1-20, 1989. Designaciones: "?" indican estructuras glicolipídicas potenciales que no se han comunicado hasta la fecha.

La sangre de grupo A y B existe en varios subtipos. Los subtipos del grupo sanguíneo A son los más frecuentes y hay tres subtipos reconocidos de tipo A de sangre. Estos subtipos se conocen como A1, A intermedio (AInt) y A2. Hay diferencias tanto cuantitativas como cualitativas que distinguen estos tres subtipos. Cuantitativamente, los eritrocitos de A1 tienen más sitios A antigénicos, es decir, residuos N-acetilgalactosamina terminales, que eritrocitos de Alnt que a su vez tienen más sitios A antigénicos que los eritrocitos de A2. Cualitativamente, los eritrocitos A1 tienen una estructura A repetida dual en un subgrupo de glucoesfingolípidos, mientras que las células A2 tienen una H en una estructura interna de un subgrupo similar de glicolípidos (Clausen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82 (4) : 1199-203, 1985, Clausen y cols., J. Biol. Chem. 261 (3) : 1380-7, 1986) . Estas diferencias entre A1 y subtipos A débiles se piensa que se refieren a las diferencias en las propiedades cinéticas de variantes de isoenzima A de grupo sanguíneo responsables de la formación de antígenos A (Clausen y cols., J. Biol. Chem. 261 (3) : 1388-92, 1986) . Las diferencias de los subtipos del grupo B se cree que son exclusivamente de naturaleza cuantitativa.

La sangre de grupo A contiene anticuerpos frente al el antígeno B. A la inversa, la sangre del grupo B contiene anticuerpos frente al antígeno A. La sangre del grupo AB no contiene ningún anticuerpo y el grupo sanguíneo 0 tiene ambos. Los anticuerpos frente a estos y otros antígenos de grupos sanguíneos definidos de carbohidratos se cree que 20 se facilitan por exposición continua a organismos microbianos que portan estructuras... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparar de un tejido para xenotrasplante, que comprende las etapas de:

(i) incubar el tejido con una enzima que tiene actividad alfa-galactosidasa,

(ii) por lo tanto escindir los residuos de galactosa terminales alfa-1-3 unidos inmunodominantes del tejido y aislar el tejido de la enzima y los residuos de galactosa inmunodominantes escindidos enzimáticamente, por lo tanto volviendo al tejido adecuado para xenotrasplante, en el que la enzima comprende al menos 10 aminoácidos en la siguiente secuencia numerados de acuerdo con ella cuando se alinean con SEC ID n.º: 2: M en residuo 10; G en residuo 47; G en residuo 84; Y en residuo 86; Y en residuo 99; N en residuo 102; K en residuo 114; T en residuo 127; G en residuo 130; G en residuo 132; G en residuo 139; N en residuo 156; D en residuo 160; P en residuo 164; G en residuo 205; R en residuo 277; R en residuo 281; F en residuo 287; G en residuo 308; Q en residuo 312; I en residuo 317; R en residuo 333; D en residuo 340; G en residuo 346; G en residuo 349; G en residuo 360; D en residuo 363; D en residuo 364; N en residuo 367; H, en residuo 369; G en residuo 370; T en residuo 371; G en residuo 396; E en residuo 462; N en residuo 463; T en residuo 465; T en residuo 467; P en residuo 468; R en residuo 483; G en residuo 484; L en residuo 486; T en residuo 489; N en residuo 498; I en residuo 508; D en residuo 513; W en residuo 517; E en residuo 519; G en residuo 521; D en residuo 525; I en residuo 528; N en residuo 531; F en residuo 533; I en residuo 549; P en residuo 553; I en residuo 573; A en residuo 590; G en residuo 595; N en residuo 601; y I en residuo 629; y en el que la enzima tiene al menos identidad del 20 % con la SEC ID N.º: 2 cuando se alinea con la SEC ID N.º: 2 y en el que la enzima tiene actividad [alfa]-galactosidasa;

(iii) aislar los eritrocitos convertidos de la etapa (ii) a partir de la enzima y los residuos de galactosa inmunodominantes escindidos enzimáticamente, escindiendo de este modo los epítopos B inmunodominantes en el eritrocito de grupo B o de grupo AB según se determina por serotipado o por ensayos de hemaglutinación.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la enzima comprende nueve aminoácidos contiguos que tienen la secuencia DD (P/A) (V/I) N (V/I) HGT (SEC ID n.º: 10) .

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, en el que la enzima comprende veintiún aminoácidos contiguos que tienen la secuencia: DXXXW (Y/F) E (S/T) GXXXD (L/Y) (L/T) I (K/R) XNXF (SEC ID n.º: 11) , donde X puede ser cualquier aminoácido.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la enzima comprende una secuencia especificada por SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7, SEC ID n.º: 8 y en el que la enzima presenta actividad alfa-galactosidasa con especificidad de sustrato ramificada, especificidad de sustrato lineal o ambas y un pH óptimo neutro.

5. Una preparación de células sanguíneas modificadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para usar en tratar un sujeto en necesidad de sangre y el cual sujeto es seropositivo para anticuerpos anti-B.

6. Una preparación de células sanguíneas modificadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en la elaboración de un medicamento para tratar un sujeto en necesidad de sangre y el cual sujeto es seropositivo para anticuerpos anti-B.

Figura 20