Un método para aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas que comprende poner en contacto una población de plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano,

CMP-ácido siálico, produciendo de esta manera una población de plaquetas modificadas que tienen residuos de glicano en superficie modificados en su extremo, en el que la población de plaquetas modificadas cuando se trasplantan en un mamífero puede circular en el mamífero durante al menos el mismo tiempo que las plaquetas no modificadas

Campo de la invención

Las invenciones se refieren a composiciones y métodos para reducir la eliminación de plaquetas transfundidas de la circulación en un mamífero, y prolongar la actividad biológica y supervivencia de las plaquetas transfundidas.

Antecedentes de la invención

Las plaquetas son células sanguíneas anucleadas derivadas de la médula ósea que evitan en mamíferos heridos pérdidas de sangre adhiriéndose a sitios de daño vascular y promoviendo la formación de coágulos de fibrina en el plasma. Los seres humanos con número reducido de plaquetas circulantes por fallo de la médula ósea padecen sangrados espontáneos que ponen en peligro su vida, y las deficiencias menos graves de plaquetas contribuyen a complicaciones de sangrado después de un traumatismo o una cirugía.

Una reducción en el número de plaquetas circulantes hasta por debajo de 70.000 por L supuestamente da como resultado una prolongación de una prueba de tiempo de sangrado cutáneo estandarizada, y el intervalo de sangrado se prolonga, extrapolando con tendencia a infinito, a medida que el recuento de plaquetas cae a cero. Se piensa que los pacientes con recuento de plaquetas de menos de 20.000 por L son altamente susceptibles a hemorragia espontánea de superficies mucosas, especialmente cuando la trombocitopenia está causada por fallo de la médula ósea y cuando los pacientes afectados sufren complicaciones con septicemia u otras agresiones. Las deficiencias plaquetarias asociadas con trastornos de la médula ósea tales como anemia aplásica, leucemias agudas y crónicas, cáncer metastásico pero especialmente que resultan de tratamientos para el cáncer con radiación ionizante y quimioterapia representan un importante problema de salud pública. La trombocitopenia asociada a cirugía mayor, daño y septicemia también deriva en administración de cantidades significativas de transfusiones de plaquetas.

Un avance principal en cuidados médicos hace medio siglo fue el desarrollo de transfusiones de plaquetas para corregir tales deficiencias plaquetarias, y más de 9 millones de transfusiones de plaquetas tuvieron lugar sólo en EE.UU. en 1999 (Jacobs y cols., 2001). Las plaquetas, sin embargo, a diferencia de todos los demás tejidos trasplantables, no toleran la refrigeración, debido a que desaparecen rápidamente de la circulación de los receptores si se someten incluso a periodos de enfriamiento muy cortos, y el efecto de refrigeración que acorta la supervivencia plaquetaria es irreversible (Becker y cols., 1973; Berger y cols., 1998).

La necesidad resultante de mantener estas células a temperatura ambiente antes de una transfusión ha impuesto un conjunto único de costosos y complejos requerimientos logísticos para el almacenamiento de plaquetas. Debido a que las plaquetas son metabólicamente activas a temperatura ambiente, se requiere una agitación constante en recipientes porosos para permitir la liberación del CO2 producido para evitar las consecuencias tóxicas de la acidosis metabólica. Las condiciones de almacenamiento a temperatura ambiente dan como resultado la degradación macromolecular y una reducción en las funciones hemostáticas de las plaquetas, un grupo de defectos conocidos como "la lesión del almacenamiento" (Chemoff y Snyder, 1992). Pero el problema principal con el almacenamiento a temperatura ambiente, que conduce a su limitación corta (5 días), es el alto riesgo de infección bacteriana. Actualmente, la contaminación bacteriana de los componentes de la sangre es la complicación infecciosa del uso de componentes de la sangre más frecuente, superando con mucho la producida por agentes virales (Engelfriet y cols., 2000). En EE.UU. se dan anualmente 3000-4500 casos de septicemia bacteriana debido a componentes sanguíneos contaminados por bacterias (Yomtovian y cols., 1993).

El mecanismo que subyace en la intolerancia única e irreversible al frío de plaquetas ha sido un misterio como lo ha sido su significado fisiológico. Las plaquetas circulantes son discos de superficie lisa que se convierten en formas complejas al reaccionar ante un daño vascular. Hace más de 40 años, los investigadores notificaron que las plaquetas discoidales también cambian de forma a temperaturas de refrigeración (Zucker y Borrelli, 1954). La subsiguiente prueba de que una forma discoidal era el mejor vaticinador de viabilidad para plaquetas almacenadas a temperatura ambiente (Schlichter y Harker, 1976) condujo a la conclusión de que el cambio de forma inducido por frío per se era responsable de la eliminación rápida de las plaquetas enfriadas. Presumiblemente las plaquetas con forma irregular deformadas por enfriamiento quedaban atrapadas en la microcirculación.

Basándose en los estudios que relacionaban la señalización con los mecanismos que conducen a los cambios en la forma de las plaquetas inducidos por ligandos, Hartwig y cols., 1995 predijeron que enfriar, inhibiendo la extrusión de calcio, podría elevar los niveles de calcio hasta un grado consistente con la activación de la proteína gelsolina, que corta los filamentos de actina y recubre los extremos positivos de los filamentos de actina. También argumentaron que una transición de fase de lípidos de membrana a temperaturas bajas agruparía los fosfoinosítidos. El agrupamiento de fosfoinosítidos elimina el recubrimiento de los extremos positivos de los filamentos de actina (Janmey y Stossel, 1989) para crear sitios de nucleación para el alargamiento de los filamentos. Aportaron pruebas experimentales para ambos mecanismos, documentando la activación de la gelsolina, la eliminación del recubrimiento de los extremos positivos de los filamentos de actina, y el ensamblaje de la actina en plaquetas enfriadas (Hoffmeister y cols., 2001; y Winokur y Hartwig, 1995). Otros habían informado de cambios espectroscópicos en plaquetas enfriadas consistentes con una transición de fase de membrana (Tablin y cols., 1996). Esta información sugirió un método para mantener la forma discoidal de las plaquetas enfriadas, usando un quelante de calcio permeable a las células para inhibir el aumento de calcio y citocalasina B para evitar el ensamblaje de la actina de extremos positivos. Aunque la adición de estos agentes mantuvo las plaquetas con forma discoidal a 4ºC (Winokur y Hartwig, 1995), tales plaquetas también se eliminan rápidamente de la circulación. Por lo tanto, permanece el problema de la eliminación rápida de las plaquetas enfriadas y son necesarios métodos para aumentar el tiempo de circulación así como el tiempo de almacenamiento para plaquetas.

El documento WO2004/043381 describe composiciones o métodos para reducir la eliminación de plaquetas, prolongar el tiempo de circulación y aumentar el tiempo de almacenamiento de las plaquetas poniéndolas en contacto con al menos un agente modificador de glicano. Mester y cols., Erythrocytes Thrombocytes, Leukocytes, INT. SYMP. 2ª fecha de reunión 1972, 257-62, EDITORS GERLACH, E. PUBLISHER: GEORG THIEME, GER. CODEN 27EEAB, 1973, describe estudios que evalúan el efecto de sialilación en la agregación de plaquetas inducida por serotonina y ADP.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona plaquetas con glicanos modificados que tienen una reducción en la incidencia de eliminación de plaquetas después de un trasplante y métodos para reducir la eliminación de plaquetas observada en un receptor de trasplante plaquetario heterólogo. También se proporcionan composiciones y métodos para la conservación y el almacenamiento de plaquetas, tales como plaquetas de mamíferos, particularmente plaquetas humanas.

Se ha descubierto ahora que el enfriamiento de plaquetas humanas causa la agrupación de complejos de subunidad  del complejo receptor (GP1b) del factor von Willebrand (vWf) en la superficie de las plaquetas. La agrupación de complejos de GP1b en la superficie de las plaquetas provoca el reconocimiento por receptores del complemento para macrófagos tipo tres (M2, CR3) in vitro e in vivo. Los receptores CR3 reconocen azúcares N-ligados con GlcNAc terminales en la superficie de las plaquetas, que han formado complejos GP1b, y fagocitan las plaquetas, eliminándolas de la circulación y dando como resultado una pérdida concomitante de la función hemostática.

Los solicitantes han descubierto que el tratamiento de plaquetas con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano CMP-ácido siálico o una mezcla de CMP-ácido siálico o UDP-galactosa conduce a la sialilación o glicación de los residuos de GlcNAc expuestos... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas que comprende poner en contacto una población de plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano, CMP-ácido siálico, produciendo de esta manera una población de plaquetas modificadas que tienen residuos de glicano en superficie modificados en su extremo, en el que la población de plaquetas modificadas cuando se trasplantan en un mamífero puede circular en el mamífero durante al menos el mismo tiempo que las plaquetas no modificadas.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto las plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de UDP-galactosa.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además enfriar la población de plaquetas antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además almacenar la población de plaquetas a temperatura ambiente antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

5. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la población de plaquetas mantiene una actividad hemostática sustancialmente normal cuando se trasplanta en un mamífero.

6. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la población de plaquetas cuando se trasplanta en un mamífero, tiene una semivida de circulación de aproximadamente un 5% o más que la semivida de circulación de plaquetas no modificadas.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la población de plaquetas modificada es adecuada para el trasplante en un ser humano.

8. Un método para aumentar el tiempo de almacenamiento de las plaquetas aisladas, que comprende poner en contacto una población de plaquetas aislada ex vivo con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano, CMP-ácido siálico, produciendo de esta manera una población de plaquetas modificadas que tienen residuos de glicano en superficie modificados en su extremo y enfriar las plaquetas para reducir el crecimiento de microorganismos en la población de plaquetas, aumentando de esta manera el tiempo de almacenamiento de la población de plaquetas.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además poner en contacto las plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de UDP-galactosa.

10. El método de la reivindicación 8, que comprende además enfriar la población de plaquetas antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

11. El método de la reivindicación 8, que comprende además almacenar la población de plaquetas a temperatura ambiente antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en el que la población de plaquetas mantiene una actividad hemostática sustancialmente normal cuando se trasplanta en un mamífero.

13. El método de la reivindicación 10 u 11, en el que la población de plaquetas cuando se trasplanta en un mamífero, tiene una semivida de circulación de aproximadamente un 5% o más que la semivida de circulación de plaquetas no modificadas.

14. El método de la reivindicación 8, en el que la población de plaquetas modificada es adecuada para el trasplante en un ser humano.

15. Una plaqueta aislada modificada para comprender una pluralidad de moléculas de glicano modificadas por sialilación terminal y moléculas de glicano modificadas por galactosilación terminal sobre la superficie de la plaqueta, en la que las plaquetas modificadas tienen una supervivencia mayor después de un trasplante en mamíferos en relación con plaquetas no modificadas.

16. Un kit que comprende un recipiente estéril que puede recibir y contener una población de plaquetas, recipiente que está sustancialmente cerrado al entorno, y una cantidad estéril de al menos un agente modificador de glicano suficiente para modificar un volumen de plaquetas recogido y almacenado en el recipiente, en el que el al menos un agente modificador de glicano es CMP-ácido siálico, kit que comprende además materiales de envasado adecuados e instrucciones de uso.

17. El kit de la reivindicación 16, en el que el recipiente es adecuado para el almacenamiento de plaquetas en frío.