CONVERSIÓN ENZIMÁTICA DE GLÓBULOS ROJOS DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS A, B Y AB UTILIZANDO A-N-ACETILGALACTOSAMINIDASAS Y A-GALACTOSIDASAS CON ESPECIFICIDADES DE SUSTRATO Y PROPIEDADES CINÉTICAS ÚNICAS.

Conversión enzimática de glóbulos rojos de los grupos sanguíneos A, B y AB utilizando -N-acetilgalactosaminidasas y -galactosidasas con especificidades de sustrato y propiedades cinéticas únicas Campo de la invención Esta invención se refiere a la eliminación enzimática de los antígenos tipo B de las células reactivas de la sangre de los grupos B y AB en los hemoderivados, y por consiguiente la conversión de éstas en células reactivas que no sean B. Específicamente esta invención se refiere a la eliminación enzimática de los monosacáridos inmunodominantes que especifican los antígenos del grupo sanguíneo B, es decir 1,3-D-galactosa. Más particularmente, esta invención se refiere al uso de -galactosidasas únicas con propiedades cinéticas superiores para la eliminación de los monosacáridos inmunodominantes de los antígenos del grupo sanguíneo B y para un mejor comportamiento en la conversión enzimática de glóbulos rojos. Esta invención se refiere además a métodos de uso de esas -galactosidasas únicas para obtener la eliminación completa de los antígenos B de las células sanguíneas tipo B y AB determinados mediante la identificación serológica estándar del grupo sanguíneo del banco de sangre y por análisis de compatibilidad cruzada. Más particularmente, esta invención se refiere a métodos de conversión de células sanguíneas, que usan cantidades significativamente menores de proteínas enzimáticas glucosidasas recombinantes que las utilizadas previamente, y que obtienen una seroconversión completa de todos los glóbulos rojos del grupo sanguíneo B. Antecedentes de la invención Según se usa en este documento, el término "hemoderivados" incluye la sangre entera y los componentes celulares derivados de la sangre, comprendidos los eritrocitos (glóbulos rojos) y las plaquetas. Hay más de 30 sistemas de grupos (o tipos) sanguíneos, uno de los más importantes de los cuales es el sistema ABO. Este sistema se basa en la presencia o ausencia de antígenos A y/o B. Estos antígenos se encuentran en la superficie de los eritrocitos y las plaquetas así como en la superficie de las células endoteliales y la mayoría de las epiteliales. El principal hemoderivado utilizado para transfusión consiste en eritrocitos, que son glóbulos rojos que contienen hemoglobina, cuya principal función es el transporte de oxígeno. La sangre del grupo A contiene antígenos A en sus eritrocitos. Análogamente, la sangre del grupo B contiene antígenos B en sus eritrocitos. La sangre del grupo AB contiene ambos antígenos, y la sangre del grupo O no contiene ninguno de los antígenos. Las estructuras del grupo sanguíneo son glucoproteinas o glucolípidos y se ha realizado un importante trabajo para identificar las estructuras específicas que constituyen los determinantes o antígenos A y B. La especificidad del grupo sanguíneo ABH se determina por la naturaleza y la unión de los monosacáridos en los extremos de las cadenas de carbohidratos. Las cadenas de carbohidratos están unidas al esqueleto de un péptido (glucoproteina) o un lípido (glucoesfingolípido), los cuales están unidos a la membrana celular de las células sanguíneas. El monosacárido inmunodominante que determina la especificidad tipo A es una N-acetilgalactosamina (GalNAc) con unión 1-3, en tanto el monosacárido correspondiente con especificidad tipo B es una galactosa (Gal) con unión 1-3. Las células sanguíneas tipo O carecen de esos monosacáridos en los extremos terminales de las cadenas de oligosacáridos, las cuales en cambio terminan en residuos de fucosa (Fuc) con unión 1-2. Se encuentra una gran diversidad de estructuras de carbohidratos del grupo sanguíneo ABH debido a las variaciones estructurales en las cadenas de oligosacáridos que tienen sacáridos inmunodominantes ABH. La tabla 1 proporciona una lista de estructuras informadas en el hombre y las que han sido encontradas en glóbulos rojos humanos o en extractos de sangre. Por una reseña, véase, Clausen & Hakomori, Vox Sang 56(1): 1-20, 1989). Los glóbulos rojos contienen antígenos ABH en glucoproteinas y glucoesfingolípidos unidos por N, aunque generalmente se cree que los glucanos unidos por O en las glucoproteinas de los eritrocitos, principalmente glucoforinas, terminan en ácido siálico y no en antígenos ABH. Los glucoesfingolípidos de cadena tipo 1 no son productos endógenos de los glóbulos rojos, sino más bien adsorbidos del plasma. Tabla I: Determinantes inmunorreactivos del grupo histosanguíneo ABH de células humanas 1 Nombre  Estructura hapteno Tipo de glucoconjugado A tipo 1, ALe d   GalNAcal-3Gaß1- 3GlcNAcß1-R  2 Encontrado en glóbulos rojos  Nº de estructura Glucolípido Glucolípido  1   2 unido por N     Fuc  1 unido por O   A tipo 1, Ale b   GalNAcal-3Gaß1- 3GlcNAcß1-R  Glucolípido Glucolípido  2     Nombre  Estructura hapteno Tipo de glucoconjugado 3 Encontrado en glóbulos rojos    2 4 unido por N     Fuc 1  Fuc 1 unido por O   A tipo 2, A  GalNAc1-3Galß1- 4GlcNAcß1-R  Nº de estructura Glucolípido Glucolípido  3   2 unido por N unido por N    Fuc  1 unido por O   A tipo 2, ALe y   GalNAc1-3Galß1- 4GlcNAcß1-R  Glucolípido Glucolípido?  4   2 3 unido por N     Fuc 1  Fuc 1 unido por O   A tipo 3, unido por O  GalNAc1-3Galß1- 3GalNAc1-O-Ser/Thr unido por O   5   2     Fuc 1    A tipo 3, Repetitivo  GalNAcl-3Galß1- 3GalNAc1-3Galß1- Glucolípido Glucolípido  6   4GlcNAcß1-R      2 2     Fuc 1  Fuc 1   A tipo 4, Globo  GalNAc1-3Galß1- 3GalNAcß1-3Gal1-R Glucolípido Glucolípido?  7   2     Fuc  1   A tipo 4, Ganglio  GalNAc1-3Galß1- 3GalNAcß1-3Galß1-R Glucolípido   8   2     Fuc 1          B tipo 1, BLe d   Gal1-3Galß1-3GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido  9   2 unido por N     Fuc  1 unido por O   B tipo 1, BLe b   Gal1-3Galß1-3GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido  10   2 4 unido por N     Fuc 1  Fuc I unido por O   B tipo 2, B  Gal1-3Galß1-4GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido  11   2 unido por N unido por N    Fuc  1 unido por O   B tipo 2, BLe y   Gal1-3Galß1-4GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido?  12   2 3 unido por N     Fuc 1  Fuc 1 unido por O   B tipo 3, unido por O  Gal1-3Galß1-3GalNAca1-O- Ser/Thr  unido por O   13     Nombre  Estructura hapteno Tipo de glucoconjugado 4 Encontrado en glóbulos rojos    2     Fuc 1    B tipo 4, Globo  Gal1-3Galß1-3GalNAcß1- 3Gal1-R  Nº de estructura Glucolípido? Glucolípido?  14   2     Fuc  1   B tipo 4, Ganglio  Gal1-3Galp1-3GalNAcß1- 3Galß1-R  Glucolípido?   15   2     Fuc  1         H tipo 1, Le d   Galß1-3GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido  16   2 unido por N     Fuc  1 unido por O   H tipo 1, Le b   Galß1-3GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido  17   2 4 unido por N     Fuc 1  Fuc 1 unido por O   H tipo 2, H  Galß1-4GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido  18   2 unido por N unido por N    Fuc  1 unido por O   H tipo 2, Le y   Galß1-4GlcNAcß1-R Glucolípido Glucolípido?  19   2 3 unido por N     Fuc 1  Fuc I unido por O   H tipo 3, unido por O  Galß1-3GalNAc1-O-Ser/Thr unido por O   20   2     Fuc  1   H tipo 3, H-A  Galß1-3GalNAc1-3Galß1- 4GlcNAcß1-R  Glucolípido Glucolípido  21   2 2 (glóbulo rojo A)    Fuc 1  Fuc 1   H tipo 4, Globo  Galß1-3GalNAcß1-3Gal1-R Glucolípido Glucolípido  22   2     Fuc  1   H tipo 4, Ganglio  Galß1-3GalNAcß1-3Galß1-R Glucolípido   23   2     Fuc 1    Thomsen- Friedenrich  Galß1-3GalNAc1-O-Ser/Thr unido por O unido por O  24 Tf, T    (+SA)  Gal-A,  Galß1-3GalNAc1-3Galß1- 4GlcNAcß1-R  Glucolípido Glucolípido  25 T de reacción 2 (glóbulo rojo A)  5  10  15  20  25  30  35  40  45  50      Nombre  cruzada  Estructura hapteno Tipo de glucoconjugado Encontrado en glóbulos rojos    Fuc  1   Tn, A de reacción cruzada  Nº de estructura GalNAc1-O-Ser/Thr unido por O unido por O  26     (+SA)  1 Adaptado de Clausen y Hakomori, Vox Sang 56(1): 1-20, 1989. Designaciones: "?" indica posibles estructuras glucolípidas que no han sido informados hasta la fecha. Los grupos sanguíneos A y B existen en varios subtipos. Los subtipos del grupo sanguíneo A son los más frecuentes y se reconocen tres subtipos principales del grupo sanguíneo tipo A. Esos subtipos se conocen como A1, A intermedio (Aint) y A2. Existen diferencias tanto cuantitativas como cualitativas que distinguen esos tres subtipos. Cuantitativamente, los eritrocitos A1 tienen más sitios antigénicos A, es decir, residuos terminales N-acetilgalactosamina, que los eritrocitos Aint los que a su vez tienen más sitios antigénicos A que los eritrocitos A2. Cualitativamente, los eritrocitos A1 tienen una estructura A dual repetida en un subconjunto de glucoesfingolípidos, mientras que los las células sanguíneas... [Seguir leyendo]

1. Una -galactosidasa para eliminar antígenos tipo B de las células reactivas de los grupos sanguíneos B o AB en los hemoderivados, donde dicha -galactosidasa tiene las características siguientes: (i) no tiene actividad detectable con un antígeno P1, (ii) es activa para escindir uniones 1,3-D-galactosa en un antígeno ramificado tipo B a pH 6-8, y (iii) se puede aislar por un método que comprende los pasos de: (1) proporcionar un cultivo de fermentación de una cepa de Streptomyces griseoplanus Nº 2357, que produce una -galactosidasa, depositada como ATCC Nº de depósito PTA-4077; (2) desestabilizar la cepa de Streptomyces griseoplanus cultivada del paso (1) mediante el método de prensa francesa; (3) aislar una fracción de sobrenadante que contenga la -galactosidasa de la cepa desestabilizada de Streptomyces griseoplanus, del paso (2) mediante centrifugación a 10 000 x g; (4) fraccionar la fracción de sobrenadante que contiene la -galactosidasa del paso (3) con sulfato de amonio para producir una fracción de 20 a 60 por ciento de sulfato de amonio enriquecida en la -galactosidasa; (5) disolver el precipitado de la -galactosidasa de la fracción de 20 a 60 por ciento de sulfato de amonio del paso (4) en Tris 20 mM (pH 7.5) y clarificar mediante centrifugación, (6) fraccionar secuencialmente mediante cromatografía en Q-sefarosa (tampón Tris 20 mM, pH 7.5 con un gradiente de NaCl 0-1.5 M), S-sefarosa (tampón de NaOAc 20 mM, pH 5.3 con un gradiente de Na Cl 0-1.0 M) y mediante cromatografía de filtración en gel S12 (tampón de NaOAc 20 mM, pH 5.3, con NaCl 0.5 M o NaPO4 20 mM, pH 6.5, con NaCl 0-5 M) para producir una -galactosidasa purificada, que eluya con un peso molecular de 40-80 kilodalton. 2. Un método para eliminar antígenos tipo B de las células reactivas de los grupos sanguíneos B o AB en un hemoderivado, donde dicho método comprende los pasos de: (a) poner en contacto dicho hemoderivado con una enzima -galactosidasa de acuerdo con la reivindicación 1, en condiciones de pH 6-8, durante un período suficiente para eliminar los antígenos B, y (b) extraer dicha enzima de dicho hemoderivado. 3. Un método para convertir eritrocitos tipo B o AB en eritrocitos que no sean B, donde dicho método comprende los pasos de: (a) poner en contacto dichos eritrocitos con una enzima -galactosidasa de acuerdo con la reivindicación 1, en condiciones de pH 6-8, durante un período suficiente para eliminar los antígenos B, y (b) extraer dicha enzima de dichos eritrocitos. 29     Figura 1. Actividad de la -galactosidasa recombinante del grano de café con Gal-pNP a diferentes pH.     Figura 2. Actividad de la -galactosidasa recombinante del grano de café con el sustrato tetrasacárido-AMC del grupo sanguíneo B a diferentes pH. 31     Figura 3. Actividad de la -galactosidasa recombinante del grano de café con el sustrato pentasacárido de Galili-AMC a diferentes pH. 32     Figura 4. Análisis por HPTLC de cinco actividades de -galactosidasa de Streptomycete con el sustrato tetrasacárido-AMC de B 33     Figura 5. Análisis por HPTLC de cinco actividades de -galactosidasa de Streptomycete con el sustrato Gal.pNP. 34     Figura 5b. Análisis por HPTLC de cinco actividades de -N-acetigalactosaminidasa de Streptomycete con los sustratos tetrasacárido-AMC del grupo sanguíneo A (Panel A) heptasacáridos-AMC de A (Panel B)     Figura 6. Análisis de la enzima -galactosidasa de Streptomycete Nº 2357 separada por cromatografía en S12 36     Figura 7. SDS-NuPAGE de fracciones combinadas de la cromatografía S12 de la actividad enzimática purificada de Nº 2357 37 PM combinación     FIGURA 8. Análisis por HPTLC de especificidades de sustrato de la -galactosidasa recombinante del grano de café y galactosidasa purificada de Nº 2357 38     FIGURA 9. Actividad de -galactosidasa purificada de Nº 2357 con el sustrato tetrasacárido-AMC del grupo sanguíneo B a diferentes pH. 39     FIGURA 9B. Análisis de la enzima -galactosidasa purificada de Streptomycete Nº 2357 con agregado de cantidades conocidas de BSA separada por cromatografía con S12             FIGURA 10. Actividad de la -N-acetilgalactosaminidasa expresada en E. coli con el sustrato tetrasacárido-AMC del grupo A a diferentes pH. 41     FIGURA 11. Influencia del sistema de tampón en la conversión enzimática de células sanguíneas A2 usando la -Nacetilgalactosaminidasa expresada en E. Coli 42     43     44         46     47       48