AGENTES DE UNIÓN A KIR Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE LOS MISMOS.

Agentes de unión a KIR y procedimientos de uso de los mismos Campo de la invención La presente invención se refiere a agentes y procedimientos que son capaces de aumentar la muerte mediada por células NK de las células diana reduciendo la señalización inhibidora de KIR. Además, la presente invención se refiere al uso de dichos agentes para la preparación de medicamentos, así como procedimientos de producir anticuerpos e hibridomas y líneas de células transfeccionadas productoras de estos anticuerpos. Antecedentes de la invención Las células asesinas naturales (NK) son una subpoblación de linfocitos implicadas en la inmunidad y en el sistema de vigilancia del sistema inmunológico del huésped. Las células NK son células mononucleares que se desarrollan en la médula ósea a partir de progenitores linfoides y las características morfológicas y las propiedades biológicas normalmente incluyen la expresión de los determinantes de grupos de determinación (cluster) (CD) CD16, CD56, y/o CD57; la ausencia del complejo del TCR alfa/beta o gamma/delta sobre la superficie celular; la capacidad de unirse y matar las células Diana que no expresan las proteínas propias del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)/antígeno leucocitario humano (HLA); y la capacidad para matar las células rumórale su otras células enfermas que expresan ligandos para activar los receptores de las NK. Las células NK se caracterizan por su capacidad para unirse y matar a varios tipos de líneas de células tumorales sin la necesidad de inmunización o activación previa. Las células NK también liberan proteínas solubles y citoquinas que ejercen un efecto regulador sobre el sistema inmunitario y pueden sufrir múltiples ciclos de división celular y producir células hijas con propiedades biológicas similares a las de la célula parental. Tras la activación mediante interferones y/o citoquinas, las células NK participan en la lisis de las células tumorales y de células infectadas por patógenos intracelulares mediante mecanismos que requieren contactos físicos directos entre la células NK y la célula diana. La lisis de las células diana implica la liberación de gránulos citotóxicos a partir de la célula NK sobre la superficie de la diana a la que se ha unido y las proteínas efectoras, como la perforina y la granzima B atraviesan la membrana plasmática diana e inducen apoptosis o muerte celular programada. Las células sanas normales están protegidas de la lisis por las células NK. En base a sus propiedades biológicas, en la técnica se han propuesto varias estrategias terapéuticas y vacunales que residen en una modulación de las células NK. No obstante, la actividad de las células NKK está regulada por un complejo mecanismo que implica señales tanto estimuladoras como inhibidoras. Brevemente, la actividad lítica de las células NK está regulada por varios receptores de superficie celular que translucen señales intracelulares positivas o negativas tras la interacción con ligandos sobre la célula diana. El equilibrio entre señales positivas y negativas transmitidas a través de estos receptores determina si una célula diana es o no lisada (eliminada) por una célula NK. Las señales estimuladoras de las células NK pueden estar mediadas por los Receptores de Citotoxicidad Natural (NCR), como NKp30, NKp44 y NKp46; así como por los receptores CD94/NKG2C, los receptores NKG2D, ciertos receptores similares a Ig activadores de las asesinas (KIR) y otros receptores activadores de NK (Lanier, Annual Review of Immunology 2005;23:225-74). Las señales inhibidoras de las células NK puede estar mediadas por receptores como Ly49, CD94/NKG2A, así como ciertos KIR inhibidores que reconocen las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I (Kärre y col., Nature 1986; 319:675-8; Öhlén y col., Science 1989;246:666-8). Estos receptores inhibidores se unen a determinantes polimórficos de las moléculas de MHC de clase I (incluido el HLA de clase I) presentes sobre otras células e inhiben la lisis mediada por las células NK. Los KIR se han caracterizado en seres humanos y primates no humanos y son moléculas transmembrana de tipo 1 polimórficos presentes sobre ciertas subpoblaciones de linfocitos, incluidas las células NK y algunas células T. Los KIR interaccionan con determinantes en los dominios alfa 1 y alfa 2 de las moléculas de MHC de clase I y, como se ha descrito anteriormente, distintos KIR son estimuladores o inhibidores para las células NK. La nomenclatura para los KIR se basa en el número de dominios extracelulares (KIR2D y KIR3D tienen dos y tres dominios extracelulares de Ig, respectivamente) y su la cola citoplasmática es larga (KIR2DL o KIR3DL) o corta (KIR2DS o KIR3DS). La presencia o ausencia de un KIR dado es variable de una célula NK a otra dentro de la población NK presente en un único individuo. Entre los seres humanos también hay un nivel relativamente alto de polimorfismo de los genes de KIR, estando presentes ciertos genes de KIR en algunos, pero no en todos, individuos. La expresión de los alelos de KIR sobre las células NK está regulada estocásticamente, lo que significa que, en un individuo dado, un linfocito dado puede expresar uno, dos o más KIR diferentes según el genotipo del individuo. Las células NK de un único individuo normalmente expresan diferentes combinaciones de KIR, lo que les proporciona un repertorio de células NK con especificidades diferentes por las moléculas de MHC de clase I. Ciertos productos del gen de KIR producen estimulación de la actividad linfocitaria cuando se unen a un ligando adecuado. Los KIR de activación tienen todos una cola citoplasmática corta con un residuo transmembrana cargado que se asocia con una molécula adaptadora que tiene motivos de activación basados en inmunorreceptores de 2   tirosina (ITAM) que transducen las señales estimuladoras a la células NK. Por el contrario, los KIR inhibidores tienen una cola citoplasmática larga que contiene motivos de activación basados en inmunorreceptores de tirosina (ITAM) que transducen las señales inhibidoras a la célula NK a través de la unión de sus ligandos del MHC de clase I. Se ha dado a conocer que la mezcla de células NK con células de insecto que expresan HLA-C era suficiente para inducir la agrupación de KIR y la fosforilación de KIR y de SHP-1 (Faure y col., J Immunol 2003; 170:6107-6114). También se ha dado a conocer que KIR2DL1 se dimerizaba en presencia de Co(2+) y la sustitución del residuo His en aminoterminal por Ala anuló la capacidad de KIR2DL1 para unirse a Co(2+) (Fan y col., J. Biol. Chem. 2000. 98:1734). Los KIR inhibidores conocidos incluyen miembros de las subfamilias de KIR2DL y KIR3DL. Los KIR inhibidores que tienen dos dominios Ig (KIR2DL) reconocen los alotipos de HLA-C: KIR2DL2 (antes denominado p58.2) y el producto génico alélico estrechamente relacionado KIRDL3 reconocen los alotipos de HLA-C de "grupo 1" (incluidos HLA- Cw1, -3, -7, y -8), mientras que KIR2DL1 (p58.1) reconoce los alotipos de HLA-C de grupo 2 (tales como as HLA- Cw2, -4, -5 y -6). El reconocimiento por KIR2DL1 está dirigido por la presencia de un residuo Lys en la posición 80 de los alelos de HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 está dirigido por la presencia de un residuo Asn en la posición 80 en el HLA-C. Es importante el hecho de que la gran mayoría de alelos de HLA-C tienen un residuo Asn o Lys en la posición 80. Por tanto, KIR2DL1, -2 y -3 reconocen en conjunto esencialmente todos los alotipos de HLA-C encontrados en los seres humanos. Un KIR con tres dominios Ig, KIR3DL1 (p70), reconoce un epítopo compartido por los alelos HLA-Bw4. Por último, KIR3DL2 (p140), existente de forma constitutiva como un homodímero unido por puentes disulfuro de moléculas con tres dominios de IG reconoce HLA-A3 y -A11. Aunque múltiples KIR inhibidores y/o otros receptores inhibidores específicos del MHC de clase I (Moretta y col., Eur J Immunogenet 1997;24(6):455-68; Valiante y col., Immunol Rev 1997;155:155-64; Lanier, Annu Rev Immunol 1998;16: 359-93) pueden estar co-expresados por las células NK, en cualquier repertorio de NK individual dado hay células que sólo expresan un único KIR y, por tanto, sólo son inhibidas por alelos específicos del MHC de clase I (o alelos pertenecientes al mismo grupo de alotipos del MCH de clase I). Las moléculas del MCH de clase I humanas a menudo se denominan antígeno de histocompatibilidad humano (HLA) de clase I. Se ha mostrado que las poblaciones o clones de células NK con fallos en la unión KIR-ligando con respecto a sus dianas, es decir que expresan KIR que no reconocen ninguna molécula del HLA de un huésped, participan en las potentes respuestas antitumorales que pueden salvar la vida que se producen tras un transplante alogénico de médula ósea en pacientes de leucemia (Ruggeri... [Seguir leyendo]

1. Un agente anticuerpo que se une a una porción extracelular de un receptor de tipo IgG de Killer humano inhibidor KIR2DL, en la que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las célula NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR. 2. El agente de la reivindicación 1, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la agrupación de KIR. 3. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR. 4. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente reduce o bloquea la interacción entre los sitios de interacción asociados con el dominio 1. 5. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente reduce o bloquea la interacción entre los sitios de interacción asociados con el dominio 1. 6. El agente de la reivindicación 5, en el que el sitio de interacción asociado con el dominio 2 de KIR2DL1 comprende los residuos aminoácidos L110, S111,A112, Q113, P/L114 y L195. 7. El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente reduce o bloquea al menos una de homodimerización, heterodimerización o ambas entre los miembros de la familia KIR. 8. El agente de la reivindicación 7, en el que el agente reduce o bloquea la homodimerización de KIR2DL1. 9. El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el agente es un anticuerpo, un fragmento de unión del mismo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo multiespecífico. 10. El agente de la reivindicación 9, en el que el fragmento se selecciona de un fragmento Fab, un fragmento Fab, un fragmento Fab-SH, un fragmento F(ab)2, un fragmento Fv, un diacuerpo y un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. 11. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. 12. El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente es un agente de unión a KIR transreactivo. 13. El agente de la reivindicación 12, en el que el agente es un anticuerpo anti-KIR transreactivo o un fragmento de unión del mismo. 14. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, en el que el agente se une a cada uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 15. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 16. El agente de la reivindicación 15, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18. 17. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 18. El agente de la reivindicación 17, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18. 19. El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usar como medicamento. 20. Una composición farmacéutica que comprende un agente de acuerdo con las reivindicaciones 1-19 en una cantidad eficaz para potenciar de forma detectable la citotoxicidad de las células NK en un paciente y uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. 21. La formulación farmacéutica de la reivindicación 20, que además comprende un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente antiangiogénico, un agente apoptótico y un anticuerpo que bloquea la unión de HLA a un receptor de KIR inhibidor. 22. Un procedimiento in vitro de reducción de la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de células NK que 82   comprende poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz del agente de cualquiera de las reivindicaciones 1-19. 23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el agente reduce o bloquea la dimerización de KIR. 24. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22 y 23, en el que el agente es un anticuerpo anti-KIR monoclonal o un fragmento de unión del mismo. 25. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 26. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 27. Un uso del agente de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer, una enfermedad infecciosa, una infección vírica o un trastorno inmunitario. 28. El uso de la reivindicación 27, en el que el medicamento es para tratar un cáncer. 29. El uso de la reivindicación 28, en el que el cáncer se selecciona de, por ejemplo, leucemia mieloide aguda y crónica (LMA y LMC), leucemia linfoide aguda (LLA), síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin (NHL), mieloma múltiple, carcinoma de células renales, melanoma maligno y cáncer colorrectal. 30. El uso de la reivindicación 27, en el que la infección vírica es causada por un virus seleccionado del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus Ébola. 31. Un agente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para usar en el tratamiento de cáncer, una enfermedad infecciosa, una infección vírica o un trastorno inmunitario. 32. El agente de la reivindicación 31 para el tratamiento de cáncer. 33. El agente de la reivindicación 31 o 32, en el que el agente es un anticuerpo monoclonal anti-KIR transreactivo humano, humanizado o quimérico o un fragmento de unión del mismo. 34. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 35. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 36. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, que se va a usar en combinación con un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente antiangiogénico, un agente apoptótico y un anticuerpo que bloquea la unión de HLA a un receptor de KIR inhibidor. 37. Un procedimiento de producción de un anticuerpo capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK por medio de: a) producir in vitro una combinación de anticuerpos candidatos; b) seleccionar cualquier anticuerpo candidato que se une o interacciona con la porción extracelular de un KIR2DL inhibidor; y c) seleccionar cualquier anticuerpo candidato de la etapa b) que es capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión entre el KIR inhibidor y un ligando de HLA de clase I del KIR; en donde, opcionalmente, el orden de las etapas b) y c) se invierte. 38. El procedimiento de la reivindicación 37, que comprende además una etapa de seleccionar un agente de unión a KIR transreactivo. 39. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 37 y 38, en el que el agente es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo. 40. Un procedimiento para producir un anticuerpo aislado o un fragmento de unión del mismo que es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK, que comprende las etapas de: 83   a) inmunizar un animal no humano con una composición inmunogénica que comprende al menos una porción extracelular de un KIR; b) preparar anticuerpos a partir del animal inmunizado, en el que los anticuerpos se unen al KIR; c) seleccionar un anticuerpo aislado de la etapa b) que es capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión entre el KIR inhibidor y un ligando de HLA de clase I del KIR; y d) preparar opcionalmente un fragmento del anticuerpo. 41. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión del mismo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR. 42. El anticuerpo o fragmento de unión de la reivindicación 41, que se une al mismo epítopo de KIR2DL1 como anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 43. El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 41 y 42, que comprende una región H1 de CDR correspondiente a los residuos 31-35 de la SEC ID Nº 17, una H2 de CDR correspondiente a los residuos 50-66 de la SEC ID Nº 17, una H3 de CDR correspondiente a los residuos 99-108 de la SEC ID Nº 17; una L1 de CDR correspondiente a los residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18, una L2 de CDR correspondiente a los residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18 y una L3 de CDR correspondiente a los residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18. 44. El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18. 45. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR. 46. El anticuerpo o fragmento de unión de la reivindicación 45, que se une al mismo epítopo de KIR2DL1 como anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. 47. El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 45 y 46, que comprende una región H1 de CDR correspondiente a los residuos 31-35 de la SEC ID Nº 21, una H2 de CDR correspondiente a los residuos 50-66 de la SEC ID Nº 21, una H3 de CDR correspondiente a los residuos 98-103 de la SEC ID Nº 21; una L1 de CDR correspondiente a los residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18, una L2 de CDR correspondiente a los residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18 y una L3 de CDR correspondiente a los residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18. 48. El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18. 49. Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 41 a 48. 50. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 49. 51. Una célula huésped aislada transfeccionada con el vector de acuerdo con la reivindicación 50. 52. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 51 en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo. 84     86   87   88   89     91   92   93   94     FIGURA 4 96   97   98   99