VACUNAS VIRALES MUTANTES Y SEGURAS.

Una composición de vacuna que comprende al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia,

en la que cada virus contiene una mutación en el genoma viral y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones, y en la que dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) mutantes

Campo de la Invención

La presente invención se refiere en general a vacunas adecuadas para su administración a animales contra infecciones víricas. Más específicamente, la presente invención se refiere a vacunas seguras y a procedimientos de preparación de dichas vacunas. Las vacunas de la presente invención contienen al menos dos virus mutantes vivos de 5 la misma familia o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que cada uno de los virus o los ácidos nucleicos codificantes contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).

Antecedentes de la Invención 10

La familia de virus Flaviviridae consiste en los géneros Pestivirus, Flavivirus y Hepacivirus. El género Pestivirus está representado por las especies del virus de la diarrea viral bovina 1 (BVDV-1), BVDV-2, virus de la fiebre porcina clásica y virus de la enfermedad de la frontera. Los viriones de los miembros de la familia encapsulan genomas de ARN de cadena positiva de aproximadamente 9,5 a 12,3 kb. Los ARN genómicos contienen fases de lectura abierta (ORF) largas contiguas que se traducen a poliproteínas que se procesan por proteasas celulares y virales para dar origen a las 15 proteínas virales maduras. Para miembros de Pestivirus, la ORF codifica una poliproteína de aproximadamente 3900 aminoácidos, que se procesa cotraduccionalmente y postraduccionalmente en las siguientes proteínas virales maduras (de 5' a 3'): Npro, C, Erns, E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B.

Se encuentran dos biotipos entre algunos miembros de Pestivirus basándose en su efecto sobre células de cultivo tisular, en concreto citopatógenos (citopáticos o cp) y no citopatógenos (no citopáticos o ncp). Los análisis del 20 genoma pusieron de manifiesto inserciones de secuencias celulares, a veces acompañadas por duplicación de secuencias virales, reorganizaciones genómicas y/o deleciones de secuencias virales en los genomas de pestivirus cp, pero no en los ARN de los pestivirus ncp correspondientes. Esto sugiere que los pestivirus cp han evolucionado a partir de pestivirus ncp por recombinación del ARN.

El BVDV es un patógeno de ganado ampliamente distribuido. Habitualmente, el BVDV-1 produce sólo diarrea 25 leve en animales inmunocompetentes, mientras que el BVDV-2 puede producir trombocitopenia, hemorragias y enfermedad mortal aguda. El BVDV es capaz de atravesar la placenta del ganado bovino gestante y puede dar como resultado el nacimiento de terneros persistentemente infectados (PI) (Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc. 152; 763-768 (1968); Ross, y col., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188: 618-619 (1986)). Los terneros virémicos son inmunotolerantes al virus y persistentemente virémicos durante el resto de sus vidas. Proporcionan una fuente de brotes de enfermedad de las 30 mucosas (Liess, y col., Dtsch. Tieraerzti. Wschr. 81: 481-487 (1974)) y están altamente predispuestos a la infección con microorganismos causantes de enfermedades tales como neumonía o enfermedades entéricas (Barber, y col., Vet. Rec. 117: 459-464 (1985)). Los virus de cualquier genotipo pueden existir como uno de los dos biotipos, cp o ncp. El fenotipo cp se correlaciona con la expresión de NS3, puesto que las células infectadas con BVDV cp o ncp expresan ambas NS2-3, mientras que la NS3 se detecta sólo después de la invención con BVDV cp. La NS3 es colineal a la parte C-35 terminal de NS2-3. La expresión de NS3 parece ser el resultado de alteraciones genómicas observadas para BVDV cp.

Las vacunas virales disponibles actualmente incluyen vacunas virales vivas atenuadas o muertas, vacunas de vectores vivos, vacunas de subunidades y vacunas de ADN o ARN. Véase Roth y col., “New Technogy For Improved Vaccine Safety And Efficacy”, Veterinary Clinics North America: Food Animal Practice 17(3): 585-597 (2001). La atenuación de virus puede conseguirse por irradiación UV, tratamiento químico o alto número de pases en serie in vitro. 40 Se desconoce el número, la posición y la naturaleza de las mutaciones inducidas por estos procedimientos por ausencia de análisis de la secuencia genómica. La atenuación también puede conseguirse generando alteraciones genéticas definidas, por ejemplo, la deleción específica de secuencias virales que se sabe que confieren virulencia, o la inserción de secuencias en el genoma viral. Una preocupación con respecto al uso de vacunas virales vivas atenuadas es que los virus mutantes atenuados tienen el potencial de recombinarse in vivo para eliminar la mutación o mutaciones 45 atenuantes, restaurando de este modo la virulencia. Por ejemplo, en presencia de una cepa de campo (de tipo silvestre) virulenta, los virus atenuados que tienen deleciones en el genoma viral tienen el potencial de recombinarse con la cepa virulenta para restaurar la secuencia delecionada. Véase, por ejemplo, Roth y col., anteriormente. También se ha observado que los pestivirus citopáticos que tienen inserciones celulares dan origen a virus no citopáticos en cultivo celular por deleción de las secuencias celulares, posiblemente a través de recombinación de ARN. Véase, por ejemplo, 50 Baroth y col., “Insertion of cellular NEDD8 coding sequences in a pestivirus”, Virology. 278(2): 456-66, (2000), y Becher y col., “RNA recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of letal disease”, Journal of Virology 75(14): 6256-64 (2001). Cuando se desee incluir dos virus mutantes atenuados de la misma especie, género o familia en una composición de vacuna, existe la preocupación de que los dos

virus puedan recombinarse en el animal vacunado, eliminando de este modo las mutaciones atenuantes. Véase, por ejemplo, Glazenburg y col., “Genetic recombination of pseudorabies virus: evidence that homologous recombination between insert sequences is less frequent than between autologous sequences”, Archives of Virology, 140(4): 671-85 (1995).

Continúa existiendo la necesidad de desarrollar vacunas eficaces y seguras que protejan a los animales frente 5 a infecciones víricas.

Sumario de la Invención

La presente invención proporciona vacunas seguras que contienen al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que cada virus o el ácido nucleico codificante contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus residen en el mismo 10 sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).

La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de una vacuna viral segura por selección o construcción de dos o más virus mutantes vivos de la misma familia, género o especie, en el que cada virus contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio 15 genómico, de modo que los virus mutantes no pueden experimentar recombinación homóloga para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).

La presente invención proporciona además un procedimiento de protección de un animal frente a infecciones víricas por administración al animal de una composición de vacuna de la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos 20

Figura 1. Alineamiento de las inserciones celulares y secuencias virales flanqueantes de las regiones NS2-3 de BVDV-1 cepa NADL y BVDV-2 cepa 53637.

Descripción Detallada de la Invención

Se ha reconocido excepcionalmente de acuerdo con la presente invención que virus mutantes vivos de la misma familia, que contienen mutaciones en el mismo sitio genómico de los virus, no pueden recombinarse entre sí para 25 eliminar las mutaciones.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona composiciones de vacunas seguras que contienen al menos dos, es decir, dos o más, virus mutantes vivos de la misma familia, o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no...

1. Una composición de vacuna que comprende al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia, en la que cada virus contiene una mutación en el genoma viral y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones, y en la que dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) mutantes. 5

2. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que los dos virus vivos mutantes consisten en un Virus de la Diarrea Viral Bovina Tipo 1 (BVDV-1) mutante y un Virus de la Diarrea Viral Bovina Tipo 2 (BVDV-2) mutante.

3. La composición de vacuna de la reivindicación 2, en la que los dos virus vivos mutantes consisten en un BVDV-1 citopático (cp) y un BVDV-2 cp, y ambos están atenuados.

4. La composición de vacuna de la reivindicación 3, en la que el BVDV-1 cp y el BVDV-2 cp comprenden ambos 10 una mutación en la región NS2-3 que da como resultado un biotipo citopático.

5. La composición de vacuna de la reivindicación 4, en la que el BVDV-1 cp es BVDV-1-NADL y el BVDV-2 cp es BVDV2-53637.

6. La composición de vacuna de la reivindicación 2, que comprende además al menos uno de entre herpesvirus bovino 1, virus respiratorio sincitial bovino, virus parainfluenza 3, Campylobacter fetus, Leptospira canicola, Leptospira 15 grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona o Mannhemia haemolytica.

7. La composición de vacuna de la reivindicación 1, que comprende además un vehículo veterinariamente aceptable.

8. Un procedimiento de preparación de una vacuna viral segura que comprende seleccionar o construir dos virus mutantes vivos de la misma familia, en el que cada virus contiene una mutación y las mutaciones en los virus residen en 20 el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden experimentar una recombinación homóloga para eliminar las mutaciones, y en el que los virus consisten en BVDV mutante.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha mutación se selecciona de entre una deleción, una inserción, una sustitución o una combinación de las mismas.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha mutación confiere un fenotipo seleccionado de entre la 25 atenuación de la virulencia, alteración del biotipo o tropismo celular, alteración del tropismo de especie, expresión de un casete génico extraño o una combinación de los mismos.

11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los dos virus vivos mutantes consisten en un BVDV-1 mutante y un BVDV-2 mutante.