VACUNAS DE BACTERIAS VIVAS ATENUADAS.

Una bacteria viva atenuada del género Escherichia, Yersinia o Salmonella, no teniendo dicha bacteria ARNt5 leu funcional para su uso en una vacuna

La presente invención se refiere a bacterias vivas atenuadas para su uso en un medicamento, a vacunas basadas en dichas bacterias útiles para la prevención de patogénesis microbiana, al uso de bacterias vivas atenuadas para la preparación de dichas vacunas y a métodos para la preparación de dichas vacunas.

La inmunidad frente a patogénesis microbiana es un medio por el cual un animal de sangre caliente evita la patogénesis

o padece un estado patogénico menos intenso. La inmunidad completa frente a un determinado patógeno conduce a morbilidad y mortalidad en una población expuesta a un patógeno. Esto generalmente coincide con que las vacunas basadas en microorganismos vivos pero atenuados (vacunas vivas atenuadas) inducen un tipo de respuesta inmunitaria altamente eficaz. Dichas vacunas tienen la ventaja de que, una vez vacunado el animal hospedador, la entrada del patógeno microbiano en el hospedador induce un recuerdo acelerado temprano de inmunidad humoral o mediada por células que puede controlar el crecimiento adicional del organismo antes de que la infección pueda adquirir proporciones clínicamente significativas. Generalmente se admite que las vacunas basadas en un patógeno inactivado (vacuna inactivada) no pueden conseguir este tipo de respuesta. Sin embargo, a diferencia de las vacunas inactivadas, las vacunas que contienen un patógeno vivo presentan, dependiendo del nivel de atenuación, el riesgo de que el huésped vacunado después de la vacunación pueda contraer la enfermedad contra la cual se desea la protección.

Las vacunas contra bacterias que pertenecen a las familias estrechamente relacionadas de Escherichia y Salmonella siguen las reglas generales proporcionadas anteriormente. Muchos miembros de estas familias de bacterias son patógenos debido al hecho de que infectan el tracto digestivo y la vejiga. El efecto patógeno de estas bacterias está estrechamente relacionado con su capacidad para colonizar las capas mucosas del tracto digestivo y la vejiga. Este es el fenómeno de colonización que conduce a la presencia prolongada del patógeno en el tracto digestivo y/o en la vejiga y a un contacto muy estrecho del patógeno con las capas mucosas, lo que también puede conducir a la invasión de otros tejidos. Por lo tanto, al mismo tiempo, paradójicamente, esto se debe al hecho de que estas bacterias colonizan el tracto digestivo y la vejiga, y por lo tanto al mismo tiempo producen enfermedades, que el sistema inmunitario desencadena para desarrollar un determinado nivel de respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria se desarrolla claramente demasiado tarde para suprimir el efecto patógeno de la bacteria colonizadora.

Por lo tanto sería deseable disponer de una vacuna que poseyera las cualidades inmunizadoras de un microorganismo vivo pero que no fuera capaz de causar efectos secundarios indeseables después de la vacunación.

Sin embargo, para las vacunas vivas atenuadas existe la siguiente paradoja: una estrategia para atenuar bacterias es la eliminación de uno o más factores de virulencia. En la mayoría de los casos sin embargo, los factores de virulencia también desempeñan un papel induciendo la inmunidad. En estos casos, la supresión de los factores de virulencia deteriora inevitablemente las capacidades inmunogénicas de la bacteria. Esta es por supuesto una situación no deseada. Una vacuna viva debe conservar preferiblemente el complemento antigénico de la cepa de tipo silvestre, sin ser virulenta.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna viva atenuada que no posea los diversos inconvenientes mencionados anteriormente.

Las bacterias de las familias Escherichia y Salmonella tienen diversos factores de virulencia. Un ejemplo de un solo gen implicado en la síntesis de muchos factores de virulencia, incluyendo los que desempeñan una función en la colonización de Escherichia y de Salmonella, es el gen que codifica LeuX. Este gen codifica un ARNt específico: ARNt5leu. La SEC ID Nº 1 proporciona la secuencia de un gen leuX de Salmonella typhimurium.

LeuX y su función en la colonización y síntesis de fimbrias se ha descrito entre otros por Newman et al. (Microbial Pathogenesis 17: 301-311 (1994)) and by Collighan, R.J. and Woodward M.J. (Vet. Microbiol. 80: 235-245 (2001))

Ritter et al., en Mol. Microbiol 17: 109-121 (1995) han analizado cuidadosamente las diversas funciones del producto del gen LeuX en la virulencia. Demostraron que la presencia de LeuX es crucial para la estimulación de la síntesis de fimbrias de tipo 1 y flagelos, ambos implicados en la movilidad y colonización y que es crucial para la síntesis de proteínas implicadas en la captación del hierro, para la síntesis de enterobactina y para la virulencia in vitro (véase también la solicitud de patente europea EP 1 074 266 y Ritter et al., in Mol. Microbiol 25: 871-882, 1997).

Se sabe que todas estas características contribuyen fuertemente a la virulencia. Por lo tanto, son al mismo tiempo las dianas más importantes para una respuesta inmunitaria. Una respuesta inmunitaria contra fimbrias y flagelos debe interferir con la colonización y movilidad, mientras que una respuesta inmunitaria contra enterobactina y proteínas implicadas en la captación del hierro bloquearía los efectos tóxicos y privaría a la bacteria de la posibilidad para obtener hierro esencial respectivamente.

Por lo tanto, desde el punto de vista de una vacuna, los factores de virulencia clave de elección presentes en una vacuna deben ser los factores de virulencia expresados en presencia de LeuX. Por lo tanto, la vacuna de elección sería (preferiblemente) una vacuna subunitaria que comprenda fimbrias de tipo 1, flagelos, enterobactina y proteínas implicadas en la captación del hierro. Dicha vacuna sería, en primer lugar, inocua y en segundo lugar induciría más probablemente inmunidad contra estos 4 factores de virulencia y de este modo proporcionaría protección contra la infección.

Las cepas vivas atenuadas a partir de las cuales se deleciona el gen LeuX, no fabrican los factores de virulencia mencionados anteriormente. Si fueran a usarse mutantes de deleción LeuX negativos en una vacuna, estos no inducirían protección contra estos factores de virulencia más cruciales: fimbrias, de tipo 1, flagelos, enterobactina y proteínas implicadas en la captación del hierro.

Teniendo esto en cuenta, se considera que LeuX es un candidato poco atractivo para la deleción en una cepa de vacuna viva atenuada.

Además, las bacterias que no tienen capacidades de colonización (debido a la ausencia de fimbrias de tipo 1 y flagelos) como sería el caso de los mutantes de deleción LeuX-negativos no sería de esperar que se pusieran en estrecho contacto con las células hospedadoras y por consiguiente se supone que se destruirían rápidamente. Por lo tanto, no se esperaría incluso que indujesen ninguna inmunidad sustancial contra estos factores de virulencia que aún estuviesen presentes en ausencia del producto del gen LeuX.

Sin embargo, de manera sorprendente, ahora se ha descubierto que las cepas bacterianas, tanto de la familia de Escherichia como Salmonella, no tienen un ARNt5leu funcional y que son muy capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora contra bacterias virulentas de tipo silvestre en un animal hospedador. Esto es de hecho contra todas las expectativas, ya que no inducen ninguna inmunidad contra los factores de virulencia clave mencionados anteriormente.

Por lo tanto, una primera realización de la presente invención se refiere a bacterias vivas atenuadas que no tienen ARNt5leu funcional, para su uso en una vacuna.

Dobrindt U., et al., (FEMS Microbiology letters 162: 135-141 (1998)) han confirmado que el ARNt5leu codificado por LeuX es en efecto el responsable, por ejemplo, de la supervivencia de una E. coli uropatógena en el mucus de vejiga de ratón y no la presencia de las islas de patogenicidad como tal. Estas islas de patogenicidad son las regiones que codifican, por ejemplo hemolisinas, adhesinas fimbriales y demás.

leu leu

Debido a su posición clave en la patogenicidad bacteriana, el gen ARNt5 y su producto génico ARNt5 están ampliamente difundidos en el reino bacteriano. El ARNt5leu está muy conservado. Puede encontrarse, por ejemplo, en las especies de Escherichia coli y Salmonella enterica, tales como del serotipo typhimurium, enteriditis, galinarum y dublin y en especies de Yersinia tales como Y. pestis.

Entre otros, Thorbjarnardottir, S. et al. (J.... [Seguir leyendo]

1. Una bacteria viva atenuada del género Escherichia, Yersinia o Salmonella, no teniendo dicha bacteria ARNt5leu funcional para su uso en una vacuna.

2. Una bacteria viva atenuada para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, no teniendo dicha bacteria ARNt5leu funcional como resultado de una mutación en el gen leux.

3. Una bacteria viva atenuada para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, seleccionándose dicha bacteria del grupo que consiste en E.coli, S. enterica del serotipo typhimurium, enteriditis, choleraesuis, dublin, typhi, gallinarum, abortusovi, abortus-equi o pullorum.

4. Una bacteria viva atenuada para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizada por que la mutación comprende una inserción y/o una deleción.

5. Una bacteria viva atenuada para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, caracterizada por que dicha bacteria lleva un gen heterólogo.

6. Una bacteria viva atenuada para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada por que el gen heterólogo se inserta en el gen leux.

7. Una bacteria viva atenuada para la protección de animales y seres humanos contra una infección por una bacteria patógena o los efectos patógenos de la misma, caracterizada por que dicha vacuna comprende una bacteria como se define en las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una vacuna viva atenuada de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que comprende un adyuvante.

9. Una vacuna viva atenuada de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizada por que se presenta en forma liofilizada.

10. El uso de una bacteria viva atenuada como se define en las reivindicaciones 1-6 para la fabricación de una vacuna para la protección de animales contra una infección por una bacteria patógena o los efectos patógenos de una infección.

11. Un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 7-9, caracterizado por que dicho método comprende la mezcla de una bacteria viva atenuada como se define en las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.