FASE SÓLIDA PARA USO EN UN PROCEDIMIENTO PARA LA PURIFICACIÓN DE CONJUGADOS DE ALBÚMINA.

Una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica a la que está unida un conjugado de albúmina,

en la que dicho conjugado de albúmina comprende una molécula seleccionada del grupo constituido por un péptido, un ADN, un ARN, vinorelbina, gemcitabina, paclitaxel, y una combinación de los mismos, en la que dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica es una columna que contiene una resina hidrófoba seleccionada del grupo constituido por octilsefarosa, fenilseparosa y butilsefarosa, en el la que dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica está en contacto con albúmina conjuntada

(a) Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento de purificación para el aislamiento de conjugados de albúmina de una solución que comprende tanto conjugados de albúmina como albúmina no conjugada.

(b) Descripción de la técnica anterior

Los documentos WO 95/10302 y WO 99/24074 describen la formación de conjugados de albúmina en los que la molécula de interés tiene una funcionalidad reactiva acoplada a la misma que está adaptada para unirse covalentemente a albúmina, formando de este modo un conjugado. Estos conjugados se pueden formar in vivo, pero también se pueden formar in vitro. La formación del conjugado in vitro implica la adición de una molécula acoplada a una funcionalidad reactiva a una solución de albúmina. Los productos finales primarios de esta reacción son albúmina no conjugada, el conjugado de albúmina y la molécula no reaccionada acoplada con la funcionalidad reactiva.

Sería muy deseable proporcionar un procedimiento de purificación de conjugado de albúmina de una solución que comprende conjugado de albúmina y albúmina no conjugada. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con la presente invención se proporciona una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica a la que está unida un conjugado de albúmina, en el que dicho conjugado de albúmina comprende una molécula seleccionada del grupo constituido por un péptido, un ADN, un ARN, vinorelbina, gemcitabina, paclitaxel, y una combinación de los mismos, en el que dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica está en contacto con albúmina conjuntada

En una realización preferida de la presente invención el conjugado de albúmina consiste en una molécula que tiene un aceptor de Michael acoplado covalentemente a la misma que se une a albúmina, y más preferiblemente el enlace está entre el aceptor de Michael y cisteína 34 de albúmina.

En una realización más preferida de la presente invención el aceptor de Michael es un grupo maleimida, y más preferiblemente, el grupo maleimida es ácido maleimida-propiónico (MPA). El aceptor de Michael está acoplado de forma opcional a la molécula mediante un adaptador. El adaptador se selecciona preferiblemente del grupo constituido por motivos hidroxietílicos tales como ácido (2-amino)epoxi-acético (AEA), etilendiamina (EDA), ácido 2-[2(2-amino)etoxi)]etoxiacético (AEEA), ácido aminoetoxietilaminosuccínico (AEEAS); una o más motivos de cadenas de alquilo (C1-C10) tales como glicina, ácido 3-aminopropiónico (APA), ácido 8-aminooctanoico (AOA), ácido octanoico (OA), ácido 4-aminobenzoico (APhA). Son adaptadores preferidos OA, ADE, AEA, AEEA y AEEAS. Se puede usar también una combinación de dos adaptadores tales como, por ejemplo, AEEA-EDA, AEEA-AEEA, AEEASAEEAS y AEA-AEEA.

En una realización preferida de la presente invención la albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina de suero, albúmina recombinante y albúmina de una fuente genómica.

En una realización preferida de la presente invención, la albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina humana, albúmina de rata, albúmina de ratón, albúmina de cerdo, albúmina bovina, albúmina de perro y albúmina de conejo, más preferiblemente albúmina de suero humano.

En una realización preferida la albúmina es modificada con al menos uno seleccionado del grupo constituido por ácidos grasos, iones metálicos, moléculas pequeñas que presentan gran afinidad con la albúmina, y azúcares, tales como glucosa, lactosa y manosa, pero sin limitarse a ellos.

En una realización preferida de la presente invención, la molécula se selecciona del grupo constituido por un péptido, ADN, ARN, molécula orgánica pequeña y una combinación de los mismos. El péptido tiene preferentemente un peso molecular de al menos 57 daltons. Se pretende que el péptido incluya, pero sin limitarse a estos, GLP-1, GLP-2, ANP, K5, dinorfina, GRF, insulina, péptidos natriuréticos, T-20, T-1249, C-34 y PYY. La molécula pequeña se pretende que incluya, pero sin limitarse a estas, vinorelbina, gemcitabina y paclitaxel. En una realización más preferida de la presente invención, cuando la molécula es un ADN, ARN o una molécula orgánica pequeña, está unida covalentemente a la albúmina a través de un enlace covalente sensible a ácido o una secuencia de péptidos susceptible de escisión proteolítica, con lo que se posibilita la separación de la molécula de albúmina y la entrada de la molécula en una célula.

En una realización preferida de la presente invención, el soporte sólido hidrófobo es una columna que contiene una resina hidrófoba tal como, aunque sin limitarse a ellas, octilsefarosa, fenilsefarosa y butilsefarosa y más preferiblemente butilsefarosa.

En otra realización preferida de la presente invención, el soporte sólido hidrófobo que comprende un ligando hidrófobo tal como Cibacron Blue F3G-A, grupos éter o isopropilo junto con un soporte tal como matriz de poliestireno/divinilbenceno.

Las sustancias se separan en base a sus resistencias variables de interacciones hidrófobas con ligandos hidrófobos inmovilizados a una matriz no cargada. Esta técnica se lleva a cabo normalmente con concentraciones moderadamente altas de sales (1 M) en el tampón de partida (adsorción promovida por sal). La elución se consigue mediante una reducción lineal o en etapas en la concentración de sal.

El tipo de ligando, el grado de sustitución, el pH y el tipo y concentración de sal usados durante la fase de adsorción tienen un efecto profundo en el rendimiento global (por ejemplo, selectividad y capacidad) de una matriz de HlC (matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica).

El disolvente es uno de los parámetros más importantes que influyen en la capacidad y selectividad en HIC (cromatografía de interacción hidrofóbica). Por lo general el proceso de adsorción es más selectivo que el proceso de desorción. Por tanto es importante optimizar el tampón de partida en lo que respecta a pH, tipo de disolvente, tipo de sal y concentración de sal. La adición de diversas sales “de efecto de saturación” (“salting-out”) a la muestra promueve las interacciones de ligando-proteína en HIC. Cuando la concentración de sal aumenta, la cantidad de proteína unida aumenta hasta el punto de precipitación de la proteína. Cada tipo de sal difiere en su capacidad para promover interacciones hidrofóbicas. La influencia de diferentes sales en interacción hidrofóbica sigue las series de Hofmeister bien conocidas siguientes: Series de Hofmeister Efecto de saturación con sales Aniones:

PO43-> SO42-> CH3COO-> Cl-> Br > NO3 > ClO4 > SCN-Efecto caotrópico Cationes:

NH4+ < Rb+ <K+< Na+<Cs+ < Li+<Mg2+ < Ba2+

Aumentando el efecto de saturación con sales se refuerza las interacciones hidrofóbicas, mientras que aumentando el efecto caotrópico se debilitan. Por lo tanto el sulfato de amonio muestra un efecto de saturación con sales más fuerte que el cloruro de sodio. Las sales más habitualmente usadas para HIC son sulfato de amonio ((NH4)2SO4), sulfato de sodio ((Na)2SO4)), sulfato de magnesio (MgSO4), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) y acetato de amonio (CH3COONH4).

La unión de proteína a adsorbentes de HIC es promovida mediante concentraciones de moderadas a altas de sales “de efecto de saturación”, la mayoría de las cuales también tienen una influencia estabilizante sobre la estructura de la proteína debido a su exclusión preferencial de proteínas globulares nativas, es decir, la interacción entre la sal y la superficie de la proteína es termodinámicamente desfavorable. La concentración de sal debería ser suficientemente alta (por ejemplo, de 500 a 1000 mM) para promover las interacciones ligando-proteína aún por debajo de la que provoca la precipitación de la proteína en la muestra. En el caso de albúmina la concentración de sal debería mantenerse por debajo de 3 M (moles por litro). El mecanismo principal de de saturación con sales consiste en el aumento inducido por sal de la tensión superficial de agua (Melander and Horváth, 1977). Por tanto una estructura compacta llega a ser energéticamente más favorable debido a que corresponde a menor área interfacial de la solución de proteína.

De forma interesante se ha encontrado que en las mismas condiciones (es decir, tampón compuesto por SO42-, PO42-o CH3COO-con cualquier contraión), estas sales muestran...

1. Una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica a la que está unida un conjugado de albúmina, en la que dicho conjugado de albúmina comprende una molécula seleccionada del grupo constituido por un péptido, un ADN, un ARN, vinorelbina, gemcitabina, paclitaxel, y una combinación de los mismos, en la que dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica es una columna que contiene una resina hidrófoba seleccionada del grupo constituido por octilsefarosa, fenilseparosa y butilsefarosa, en el la que dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica está en contacto con albúmina conjuntada.

2. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de la reivindicación 1, en la que dicha molécula está unida covalentemente, opcionalmente por medio de un adaptador, con un aceptor de Michael unido covalentemente a albúmina.

3. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de la reivindicación 2, en la que dicho aceptor de Michael está unido covalentemente a cisteína 34 de dicha albúmina.

4. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de la reivindicación 2 ó 3, en la que dicho aceptor de Michael es un grupo maleimida.

5. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de la reivindicación 4, en la que dicho grupo maleimida es ácido maleimida-propiónico (MPA).

6. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha molécula es un péptido.

7. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de la reivindicación 6, en la que dicho péptido tiene un peso molecular de al menos 57 dalton.

8. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha molécula es del grupo constituido por péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), péptido natriurético atrial (ANP), kringle 5 (K5), dinorfina, exendina-4, factor de liberación de la hormona del crecimiento (GRF), insulina, péptidos natriuréticos, enfuvirtida (T-20), T-1249, C-34, péptido EF C-35 soluble (SC-35), péptido YY (PYY) y análogos de los mismos.

9. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula es un péptido unido covalentemente a dicha albúmina a través de un enlace covalente sensible a ácido o una secuencia de péptido susceptible de escisión proteolítica, con lo que se posibilita la separación de dicha molécula y albúmina y la entrada de la molécula en una célula.

10. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica está en contacto con un tampón acuoso que tiene una concentración de sal alta, suficiente para promover las interacciones ligando-proteína.

11. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica está en contacto con un gradiente de concentración de sal decreciente que tiene una concentración de sal de partida inferior a 3000 mM.

12. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de la reivindicación 11, en la que dicho gradiente de concentración de sal decreciente tiene una concentración de sal de partida entre 500 y 1000 mM.

13. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que dicha sal se selecciona del grupo constituido por fosfato de amonio, sulfato de amonio y fosfato de magnesio.

14. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha molécula es un análogo de: péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), péptido similar al glucagón tipo 2 (GLP-2), péptido natriurético atrial (ANP), kringle 5 (K5), dinorfina, exendina-4, factor de liberación de la hormona del crecimiento (GRF), insulina, péptidos natriuréticos, enfuvirtida (T-20), T-1249, C-34, péptido EK C-35 soluble (SC35) o péptido YY (PYY).

15. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicho conjugado de albúmina se forma haciendo reaccionar albúmina con GLP-1 (7-36) dA1a8 Lys37 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 1), GRF (1-29)

dAla2 Gln8 Ala15 Leu27 Lys30 (ε-MPA) CONH2 (SEC ID nº 2), Ac-K5 Lys8 (ε-MPA)-NH2 (SEC ID nº 3), insulina B1-MPA (SEC ID nº 4), insulina A1-MPA (SEC ID nº 5), MPA-AEEA-C34-CONH2 (SEC ID nº 6), C34 (1-34) Lys35 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 7), C34 (1-34) Lys13 (εAEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 8), GLP-1 (7-36) Lys37 (ε-MPA)-NH2 (SEC ID nº 9), GLP-1 (736) dAla8 Lys37 (ε-MPA)-NH2 (SEC ID nº 10), GLP-1 (7-36) Lys26 (ε-AEEA-AEEA-MPA) (SEC ID nº 11), GLP-1 (7-36) Lys34 (ε-AEEA-AEEA-MPA) (SEC ID nº 12), exendina-4-(1-39) Lys40 (εMPA)-NH2 (SEC ID nº 13), exendina-4-(9-39) Lys40 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 14), Dyn A (1-13) (MPA)-NH2 (SEC ID nº 15), MPA-AEEA-ANP (99-126)-CONH2 (SEC ID nº 16), Dyn A (7-13) Lys13 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 17), acetil-Phe-His-ciclohexilestatil-lle-Lys (εAEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 18), GLP-1 (7-36) Lys23 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 19), GLP-1 (7-36) Lys18 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 20), GLP-1 (7-36) Lys26 (ε-AEEAMPA)-CONH2 (SEC ID nº 21), GLP-1 (7-37) Lys27 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 22), GLP1 (7-36) Lys37 (ε-AEEA-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 23), GLP-1 (7-36) Lys37 (ε-AEEAMPA)-CONH2 (SEC ID nº 24), exendina-4-(1-39) Lys40 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 25), GLP-1 (7-36) Lys34 (ε-AEBA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 26), insulina B1-OA-MPA (SEC ID nº 27), insulina B29-MPA (SEC ID nº 28), GRF (1-29) Lys30 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 29), GRF (1-29) dAla2 Gln8 dArg11 Ala15 Leu27 Lys30 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 30), GRF (1-29) dAla2 Lys30 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 31), GLP-1 (9-36) Lys37 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 32), Ac-T20 (1-36) Lys37 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 33), Ac-T1249 (1-39) Lys40 (εAEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 34), C34 (1-34) Lys13 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 36), C34 (134) Lys35 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 37), MPA-C34 (1-34)-CONH2 (SEC ID nº 38), Ac-C34 (134) Glu2 Lys6 Lys7 Glu9 Glu10 Lys13 Lys14 Glu16 Glu17 Lys20 Lys21 Glu23 Glu24 Lys27 Glu31 Lys34 Lys35 Lys36 (ε-AEEA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 39), MPA-AEEA-C34 (1-34) Glu2 Lys6 Lys7 Glu9 Glu10 Lys13 Lys14 Glu16 Glu17 Lys20 Lys21 Glu23 Glu24 Lys27 Glu31 Lys34 Lys35 CONH2 (SEC ID nº 40), PYY (3-36) Lys4 (ε-OA-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 41), MPA-OA-PYY (3-36)-CONH2 (SEC ID nº 42), insulina B29-AEES2-MPA (SEC ID nº 43), insulina B1-AEES2-MPA (SEC ID nº 44), insulina B29-OA-MPA (SEC ID nº 45), MPA-PYY (3-36)-CONH2 (SEC ID nº 46), PYY (3-36) Lys37 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 47), MPA-PYY (22-36)-CONH2 (SEC ID nº 48) acetil-PYY (22-36) Lys37 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 49), MPA-ANP (99-126)-CONH2 (SEC ID nº 50), MPA-EEEEP-ANP (99-126) (SEC ID nº 51) o GLP-2 (1-33) Gly2 Lys34 (ε-MPA)-CONH2 (SEC ID nº 52).

16. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha molécula es insulina B1.

17. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha molécula es exendina-4 (1-39) Lys40 .

18. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de unacualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho conjugado de albúmina se forma haciendo reaccionar albúmina con exendina-4 (1-39) Lys40 (ε-AEEA-MPA)-CONH2.

19. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho conjugado de albúmina se forma haciendo reaccionar albúmina con insulina B1-OA-MPA.

20. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina del suero y albúmina recombinante.

21. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina humana, albúmina de rata, albúmina de ratón, albúmina de cerdo, albúmina bovina, albúmina de perro y albúmina de conejo.

22. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha albúmina es albúmina de suero humano.

23. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha albúmina está modificada con al menos una seleccionada del grupo constituido por un ácido graso, un ión metálico y un azúcar.

24. La matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha albúmina está modificada con un azúcar seleccionado del grupo constituido por glucosa, lactosa y manosa.