USO DE CONJUGADOS DE DOXORRUBICINA CON ALBÚMINA LACTOSAMINADA.

Uso de un conjugado de doxorrubicina con albúmina lactosaminada para la preparación de un medicamento para el tratamiento de los carcinomas hepatocelulares que no expresan el receptor de las asialoglucoproteínas

El objeto de la presente invención es el uso de un conjugado de doxorrubicina con albúmina humana lactosaminada para la preparación de una composición farmacéutica útil en el tratamiento de carcinomas hepatocelulares (hepatocellular carcinoma, HCC) que no expresan el receptor de la asialoglucoproteína (ASGP-R). El conjugado, que fue previamente preparado y estudiado únicamente para el tratamiento de HCC que expresan el ASGP-R, ahora ha mostrado inesperadamente poseer la potencialidad de un uso beneficioso también en el tratamiento de los HCC que no tienen el receptor. Por lo tanto, las composiciones que contienen el conjugado podrían ser administradas para el tratamiento de todas los HCC, sin necesidad de una biopsia tumoral preliminar para demostrar la presencia o la ausencia del receptor. En experimentos anteriores, acoplamos doxorrubicina (DOXO) a albúmina humana lactosaminada (lactosaminated human albumin, LHSA) con objeto de incrementar la actividad anticancerosa del fármaco y reducir sus efectos secundarios tóxicos en el tratamiento de aquellos carcinomas hepatocelulares cuyas células expresan el receptor para las asialoglucoproteínas (ASGP-R) (Di Stefano G, y col. Doxorubicin coupled to lactosaminated human albumin... Dig Liver Dis 2003; 35: 428-433; Fiume L, y col. Doxorubicin coupled to lactosaminated albumin... J Hepatol 2005; 43: 645-652). Los HCC son tumores resistentes a los agentes quimioterapéuticos; la DOXO es activa en los HCC, pero muestra unas graves reacciones adversas a las dosis eficaces (Llovet JM. Updated treatment... J Gastroenterol 2005; 40: 225-235). Los efectos tóxicos de la DOXO son producidos principalmente en el corazón, la médula ósea y el intestino (Mazuè G, y col. Anthracyclines: a review... Int J Oncol 1995; 7: 713-26). El ASGP-R está presente únicamente en la superficie de los hepatocitos. Media en la captación y la degradación lisosómica de los péptidos terminados en galactosilo (Ashwell G, y col. Carbohydrate-specific... Annu Rev Biochem 1982; 51: 531-534), que pueden ser usados como vectores para la administración selectiva del fármaco a las células hepáticas parenquimatosas (Fiume L, y col. Liver targeting of antiviral nucleoside analogs through the asialoglycoprotein receptor. J Viral Hep 1997; 4: 363-370). La L-HSA es una neoglucoproteína terminada en galactosilo que se ha usado con éxito como portador de fármacos hepatotropos en seres humanos (Torrani Cerenzia MR, y col. Adenine arabinoside monophosphate... Hepatology 1996; 23: 657-661; Zarski JP, y col. Efficacy and safety of L-HSA-ara-AMP... J Hepatol 2001; 34: 487-488). La DOXO se acopló a la L-HSA mediante un enlace hidrazona sensible a ácido que permite que la DOXO sea liberada intracelularmente desde el portador en los compartimentos endosómico y lisosómico (Greenfield RS, y col. Evaluation in vitro of adriamycin... Cancer Res 1990; 50: 66006607). (El procedimiento de conjugación está cubierto por una patente depositada por la Universidad de Bolonia (PCT/IT2005/000257)). El ASGP-R está conservado en las células neoplásicas de la mayoría de los HCC humanos bien diferenciados (well differentiated, WD), mientras que no es expresado en las células de la mayoría de los HCC poco diferenciados (poorly differentiated, PD) (Hyodo I, y col. Distribution of asialoglycoprotein receptor... Liver 1993; 13: 80-85; Trerè D, y col. The asialoglycoprotein receptor... Br J Cancer 1999; 81: 404-408; Sawamura T, y col. "Hyperasialoglycoproteinemia in patients..." Gastroenterology 1984; 87: 1217-1221). La presencia o la ausencia del ASGP-R en los HCC humanos puede determinarse inmunohistoquímicamente usando biopsias con agujas o fragmentos procedentes de tumores extirpados quirúrgicamente. En ratas con HCC inducidos por dietilnitrosamina (DENA) se encontró la capacidad de los tumores de internalizar la L-HSA a través del ASGP-R en todos los 7 HCC WD estudiados, en 4 de los 5 tumores moderadamente diferenciados (moderately differentiated, MD), mientras que se observó una baja capacidad de captación de la L-HSA sólo en 2 de los 5 HCC PD (Di Stefano G, y col. Enhanced uptake of lactosarninated... Liver Int 2005; 25: 854-860).

En experimentos sobre la distribución de una L-HSA-DOXO radioactiva en HCC y órganos de ratas, realizamos dos observaciones inesperadas y relacionadas:

1 - Los HCC PD internalizan cantidades de conjugado tres veces mayores que las de L-HSA

2 - En todas las formas de HCC, independientemente de su grado de diferenciación, el conjugado producía altas concentraciones de DOXO, 5-8 veces mayores que las medidas en intestino y corazón.

Materiales y Métodos

Síntesis y caracterización de la L[14C]HSA-DOXO

Se obtuvo albúmina humana (HSA) de Kedrion (Lucca, Italia). Se filtró en gel con Sephacryl S-200 HR (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y el monómero (> 90% del material de partida) se recogió y usó. La HSA se marcó con [14C]-sacarosa. La [14C]-sacarosa es un marcador radioactivo que permanece dentro de las células en las que penetra, permitiendo una determinación exacta de la captación de proteínas en los tejidos (Pittman RC, y col. "Radiolabeled sucrose..." J Biol Chem. 1979; 254: 6876-6879). Se diluyó [14C]-sacarosa (500 mCi/mmol, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) hasta una actividad específica de 3,2 x 105 dpm/µg. El acoplamiento de la [14C]-sacarosa a la HSA se realizó según Pittman RC y col. ("Radiolabeled sucrose..." J Biol Chem. 1979; 254: 6876-6879). Dado que este procedimiento provoca una oligomerización de la proteína, la HSA marcada se cromatografió en una columna Sephacryl S200 HR sobre gel, y se recogió el monómero (70% de la preparación). La proporción molar [14C]-sacarosa/HSA se determinó midiendo la radioactividad y midiendo la proteína según Lowry OH y col. ("Protein measurement..." J Biol Chem 1951; 193: 265-275), y era de 0,2. Se acopló α-lactosa (Sigma) a la [14C]HSA mediante una aminación reductora (Wilson

G. "Effect of reductive lactosamination..." J Biol Chem 1978; 253: 2070-2072). La proporción molar lactosa/[14C]HSA se determinó midiendo el azúcar según Dubois M y col. ("Colorimetric method for determination..." Anal Chem 1956; 28: 350-356) y era de 26. El acoplamiento de la DOXO a la L-[14C]HSA se realizó usando el derivado (6-maleimidocaproil)hidrazona del fármaco (DOXO-EMCH), sintetizado según Willner D, y col. ("(6-maleimidocaproyl)hydrazone derivative..." Bioconj Chem 1993; 4: 521-527). El acoplamiento de la DOXO-EMCH con la L-[14C]HSA se llevó a cabo según Di Stefano G, y col. ("A novel method for coupling..." Eur J Pharm Sci 2004; 23: 393-397), adjuntado aquí como referencia, pero permitiendo que los compuestos reaccionen a 20°. Las proporciones molares DOXO/L-[14C]HSA se calcularon midiendo la concentración de proteínas según Lowry OH, y col. (Protein measurement...J Biol Chem 1951; 193: 265-275) y la DOXO mediante absorbancia a º495 [º495 (pH 7,4) de DOXO-EMCH = 9250 M-1 cm-1]. Era de 5,8 (había 1 mg de DOXO contenida en 24 mg de conjugado; 24 mg de conjugado contenían 22,5 mg de L-HSA).

Inducción de HCC en ratas; distribución del conjugado y concentraciones de DOXO en tumores y órganos.

Se usaron ratas Wistar macho. Se obtuvieron de Harlan Italia (Udine, Italia) y se mantuvieron en una instalación para animales en el Departamento de Patología Experimental, Bolonia. Los protocolos de los experimentos fueron aprobados por el Comité Ético de La Universidad de Bolonia.

Los HCC fueron inducidos mediante dietilnitrosamina (DENA) administrada en el agua de bebida (100 mg/l) durante 8 semanas. Entre seis y ocho semanas después del último día de la administración de la DENA, a los animales se les inyectaron por vía i.v. los siguientes compuestos: L-[14C]HSA (22,5 µg/g), L[14C]HSA-DOXO (24 µg/g, correspondientes a 22,5 µg/g de L-[14C]HSA y a 1 µg/g de DOXO) y DOXO libre (1 µg/g). Los compuestos fueron inyectados en la vena dorsal del pene, en un volumen de 10 µl/10 g de peso corporal, bajo anestesia con isoflurano. Se usaron cuatro ratas para cada compuesto. Cuatro horas después de la inyección, los animales fueron sacrificados bajo anestesia con isoflurano. Los órganos se extrajeron rápidamente y se congelaron, y los nódulos neoplásicos fueron diseccionados con precisión desde el hígado circundante. Una parte de cada nódulo tumoral se congeló; la otra parte se fijó en formalina al 10% y se procesó para histología. Las muestras de órganos y nódulos congelados se usaron para medir la radioactividad y la determinación de los niveles de DOXO. La DOXO se midió según Bots AM, y col.... [Seguir leyendo]

1. Uso de un conjugado de doxorrubicina con albúmina lactosaminada para la preparación de un medicamento para el tratamiento de los carcinomas hepatocelulares que no expresan el receptor de las asialoglucoproteínas.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la administración del conjugado no comprende la demostración preliminar de la presencia o la ausencia del receptor de las asialoglucoproteínas en las células tumorales.

3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicha albúmina lactosaminada es albúmina humana lactosaminada.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho medicamento es administrable mediante vía parenteral.

5. Uso según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho medicamento es administrable mediante vía intravenosa, mediante bolo o mediante infusión.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho 15 medicamento es una disolución acuosa.

7. Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha disolución acuosa contiene excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables.