HAPTENOS, INMUNÓGENOS, ANTICUERPOS Y CONJUGADOS PARA LSD 2-OXO-3-HIDROXI.

Un hapteno que tiene la siguiente Fórmula estructural: - en la que R es un enlace bivalente y X es un grupo funcional para acoplar a un material portador que confiere antigenicidad o a un agente de marca detectable

Antecedente

La presente invención se relaciona con haptenos que se utilizan para la preparación de inmunógenos, anticuerpos y conjugados para uso en inmunoensayos competitivos para la detección del metabolito LSD principal, 2-oxo-3hidroxi-LSD.

La presente invención también se relaciona con un método y equipo para detectar o determinar 2-oxo-3-hidroxi-LSD. El método y equipo de la presente invención están destinados a no reaccionar significativamente en forma cruzada con el LSD progenitor en sí mismo o con nor-LSD.

"Detectar" significa analizar cualitativamente la presencia o ausencia de una sustancia.

"Determinar" significa analizar cuantitativamente la cantidad de una sustancia.

El ácido dietilamida lisérgico (LSD) (Figura 1, 1) es un compuesto psicoactivo poderoso. Este se clasifica como un fármaco de Esquema I. El compuesto está disponible en píldoras, soluciones y cubos de azúcar impregnados, papel secante o comprimidos de vitamina.

El LSD es un halucinógeno muy potente, 10-150 veces tan potente como silocibina y 4500-9275 veces tan potente como mescalina. El compuesto isomérico d-iso-LSD (Figura 1, 2) es inactivo.

Con las crecientes restricciones en la administración del LSD a sujetos humanos, se limita el conocimiento actual en la distribución, el perfil metabólico y la extracción de LSD en el hombre. Un número considerable de reportes está disponible sobre la distribución y el perfil metabólico de LSD en animales en donde los metabolitos más comunes encontrados son nor-LSD (Figura 1, 3), 2-oxo-3- hidroxi-LSD (Figura 1, 4), 2-oxo-LSD, 13-hidroxi-LSD, 14-hidroxi-LSD, N-desetil-LSD, N-etil-N-(2-hidroxietil)- LSD (amida N), N-etil-N-vinil-LSD (amida N) y ácido lisérgico. Los metabolitos principales son nor-LSD 3 y 2-oxo- 3-hidroxi LSD 4, el último de los cuales solo se detecta recientemente en la orina humana omitida por la prueba de fármaco, su identidad se ha confirmado al comparar las características de LC-MS con un compuesto de referencia. La concentración promedio de 2-oxo-3-hidroxi-LSD 4 es 20 veces más que de LSD. En análisis de rutina de la orina humana, también se detecta d-iso-LSD 2. Este compuesto se considera que es un subproducto de la preparación ilícita de LSD.

Debido a la muy baja dosis consumida (usualmente 40 a 120µg) y debido al metabolismo rápido con menos de 1% excretado sin cambio en la orina, la identificación del LSD en las muestras biológicas es una exposición principal para los científicos forenses. Adicionalmente, la inestabilidad de LSD en ácido, el calor y la luz ha hecho su identificación aún más expuesta. Debido a que el LSD se metaboliza en un número de compuestos, los métodos más conocidos tienen por objeto identificar el LSD sin cambio (o progenitor) en las muestras biológicas.

Aunque el LSD se detecta más comúnmente en la orina mediante inmunoensayos, GC-MS, particularmente inmunoensayos de unión competitiva, sería el método de detección más simple y que ahorra más tiempo disponible. Los inmunoensayos de unión competitivos, como su nombre indica, mide la competición en la unión al anticuerpo entre una cantidad fija de antígeno marcado, el 'reactivo de detección' (o conjugado), y una cantidad desconocida de antígeno no marcado, la 'muestra'.

Los métodos de inmunoensayo comerciales para LSD incluyen procedimientos de radioinmunoensayo que son muy sensibles, pero que requieren trazadores de radionuclida, por ejemplo 125I y 3H, y, en algunos casos, una etapa de extracción preliminar. Para la prueba de fármaco en orina mediante radioinmunoensayo, se identifican muestras como positivas o negativas al comparar los conteos con aquellos de un estándar de corte que contiene 500pg/ml de LSD.

Los inmunoensayos homogéneos no isotópicos para LSD también están disponibles comercialmente. El Inmunoensayo de Donante de Enzima Clonada (CEDIA, Boehringer Mannheim) y el Inmunoensayo Multiplicado de Enzima (EMIT, Behring Diagnostics) se basan en el principio de activación de enzima. El Inmunoensayo en Línea (Roche Diagnostic Systems) se basa en la interacción cinética de las micropartículas en la solución. Estos tres ensayos se diseñan específicamente para análisis a gran escala o analizadores automáticos. El Inmunoensayo de Microplaca (STC Diagnostics) está disponible para prueba a escala pequeña. Estos inmunoensayos LSD no isotópicos se correlacionan bien con los radioinmunoensayos LSD originales.

Todos los métodos de inmunoensayo LSD disponibles comercialmente actualmente son específicos para el fármaco progenitor, LSD, y exhiben generalmente baja reactividad cruzada con metabolitos LSD.

Por ejemplo, la US 6,207,396 B1 (Microgenics Corporation) describe haptenos que son derivados del fármaco progenitor LSD (no 2-oxo-3-hidroxi-LSD), a través de la posición N-1 del anillo indol. Los anticuerpos de US 6,207,396 B1 son específicos para d-LSD y no reaccionan cruzadamente bien con 2-oxo-3-hidroxi-LSD (1.82%) o con iso-LSD (0.04%) (ver Tabla 1).

El examen de la técnica anterior falla en revelar un anticuerpo específico para 2-oxo-3-hidroxi LSD. La EP 1 148 339 A2 (Roche Diagnostics Corporation) describe haptenos derivados en la posición N-1, del anillo indol de 2-oxo-3hidroxi-LSD o de 2-oxo-LSD. Los anticuerpos obtenidos en la EP 1 148 339 A2 exhiben altos niveles de reactividad cruzada, cuando se compara con 2-oxo-3-hidroxi-LSD, para el LSD de fármaco progenitor (74.9-84.4%) y baja reactividad cruzada para el segundo metabolito, nor-LSD (1.8-4.6%) (párrafo 71).

La EP 0 816 364 A1 (F. Hoffmann-La-Roche AG) y Bioconjugate Chemistry 1997, 8, pp896-905 cada uno describe la preparación de haptenos en la posición N-1 del anillo indol LSD en sí mismo o de no LSD. Bioconjugate Chemistry 1997, 8, 896-905 describe que anticuerpos generados por inmunógeno 4 exhiben 100% de reactividad cruzada con d-LSD, 20% de reactividad cruzada con nor-LSD y 50% de reactividad cruzada con 2-oxo-3-hidroxi-LSD. Los anticuerpos generados para el inmunógeno 8 exhiben 100% de reactividad cruzada con LSD, 40% de reactividad cruzada con nor-LSD y <20% de reactividad cruzada con 2-oxo-3-hidroxi-LSD.

Clin. Chem. 23/2, 169-174 (1977) describe un radioinmunoensayo para LSD en suero y orina, empleando antisuero para dos inmunógenos diferentes, en los cuales el LSD en sí mismo se deriva en el átomo de nitrógeno indol o por medio del nitrógeno de 8β-carboxamida.

Los actuales inventores no saben de algún derivado de haptenos con un reticulador en el nitrógeno de 8β-carboxamida de 2-oxo-3-hidroxi-LSD.

Los actuales inventores también no saben de anticuerpos específicos para 2-oxo-3-hidroxi-LSD pero carecen de reactividad cruzada significativa para el LSD progenitor en sí mismo o ni para el LSD.

Objetos de la Invención:

Es un objeto de la invención superar algunas o todas las desventajas de la técnica anterior, o proporcionar una alternativa de las mismas.

Es un objeto de una realización preferida de la invención proporcionar un método y un equipo para detectar, o determinar la cantidad de, 2-oxo-3-hidroxi-LSD.

El objetivo de la presente invención es superar la carencia de los problemas específicos asociados con inmunoensayos conocidos para los metabolitos LSD, al preparar un anticuerpo altamente específico para 2-oxo-3hidroxi-LSD, que no significará reacción cruzada con el LSD progenitor o nor LSD. "No significativamente" significa una reactividad cruzada de menos de aproximadamente 25%, preferiblemente menos de aproximadamente 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente 7.5%, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 5% cuando se compara con 100% para 2-oxo-3-hidroxi-LSD. Con el fin de alcanzar tal especificidad, los haptenos descritos en la presente invención se generan mediante derivación en el nitrógeno del 8β-carboxamida de 2-oxo-3hidroxi-LSD.

Es un objeto adicional de una realización preferida de la presente invención para desarrollar anticuerpos capaces de unir con por lo menos el epítopo estructural 3-hidroxi-2-pirrolidona de 2-oxo-3-hidroxi-LSD.

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención describe un hapteno derivado con un reticulador, en el nitrógeno de 8β-carboxamida o en N-6, de 2-oxo-3-hidroxi-LSD (Figura 1, 4).

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un hapteno... [Seguir leyendo]

1. Un hapteno que tiene la siguiente Fórmula estructural:-

**(Ver fórmula)**

en la que R es un enlace bivalente y X es un grupo funcional para acoplar a un material portador que confiere 5 antigenicidad o a un agente de marca detectable.

2. Un hapteno de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que R comprende un grupo funcional alquileno, saturado o insaturado, de cadena recta o ramificada, sustituido o no sustituido; grupo funcional cicloalquileno, saturado o insaturado, sustituido o no sustituido; o un grupo funcional arileno, sustituido o no sustituido; y X comprende independientemente un ácido carboxílico o un éster del mismo, un aldehído, un ácido tiocarboxílico o un éster del mismo, preferiblemente tioacetilo, o un ácido halocarboxílico o un éster del mismo, preferiblemente haloacetilo.

3. Un hapteno de acuerdo con la Reivindicación 2, en la que R es un C1-6, más preferiblemente un grupo funcional alquileno saturado, de cadena recta, sustituido o no sustituido, C2-3.

4. Un hapteno de acuerdo con la Reivindicación 2 o 3, en la que X es ácido carboxílico.

15 5. Un hapteno de acuerdo con la Reivindicación 4, el hapteno tiene el siguiente derivado de hapteno de 2-oxo-3-hidroxi-LSD:

**(Ver fórmula)**

Hapteno A

6. Un hapteno de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que R es un grupo alquileno de cadena recta no 20 sustituido, saturado que tiene 2 átomos de carbono.

7. Un inmunógeno que comprende un hapteno de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, en las que un material portador que confiere antigenicidad se acopla a X en el hapteno.

8. Anticuerpos elevados contra el inmunógeno de la Reivindicación 7, los anticuerpos son capaces de unirse con por lo menos el epítopo estructural 3-hidroxi-2-pirrolidona de 2-oxo-3-hidroxi-LSD y en donde el anticuerpo tiene una reactividad cruzada de menos de 25% para LSD y o LSD, cuando se compara con 100% para 2-oxo-3-hidroxi-LSD.

9. Un conjugado que comprende el hapteno de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, en la que a agente de marca detectable se une convalentemente a X en el hapteno.

10. Un conjugado de acuerdo con la Reivindicación 9, en la que el agente de marca se selecciona de una enzima, una sustancia luminiscente, una sustancia radioactiva, o una mezcla de los mismos.

11. Un proceso para preparar los anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación 8, el proceso comprende las etapas de inmunizar un animal, preferiblemente un animal vertebrado, más preferiblemente un animal mamífero, mediante la administración repetida de un inmunógeno de acuerdo con la Reivindicación 7, y recolectar el suero resultante del animal inmunizado.

12. Un método para detectar o determinar 2-oxo-3-hidroxi-LSD en una muestra, el método comprende poner en contacto la muestra con el conjugado de la Reivindicación 9 o 10, o una mezcla de los mismos, y con los anticuerpos de la Reivindicación 8, o una mezcla de los mismos; detectar o determinar el conjugado vinculado; y deducir a partir de una curva de calibración la presencia de, o la cantidad de, 2-oxo-3-hidroxi-LSD en la muestra.

13. Un equipo para detectar o determinar 2-oxo-3-hidroxi-LSD, el equipo incluye el conjugado de la Reivindicación 9 o 10, o una mezcla de los mismos; y los anticuerpos de la Reivindicación 8, o una mezcla de los mismos.

14. Uso de los conjugados de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10, o una mezcla de los mismos, con los anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación 8, o una mezcla de los mismos, para detectar o determinar 2-oxo-3hidroxi-LSD en muestras tal como fluidos biológicos.

15. Anticuerpos elevados contra el inmunógeno de la Reivindicación 7, que tienen especificidad para 2-oxo-3hidroxi-LSD y que se caracterizan por tener reactividad cruzada de menos de 5% para LSD y o LSD, cuando se compara con 100% para 2-oxo- 3-hidroxi-LSD.