Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:

2 o su fragmento funcional para uso en terapia génica de una neuropatía periférica

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de forma general al campo de la ingeniería genética y más particularmente a factores de crecimiento para neuronas, sobre todo para neuronas dopaminérgicas en el SNC (sistema nervioso central) y a genes del

5 factor de crecimiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El estudio de los mecanismos de regulación del destino neuronal tiene importancia para entender la determinación, la diferenciación y el mantenimiento de las neuronas. En segundo lugar, la identificación de reguladores extracelulares e intracelulares que son importantes en la determinación del fenotipo neuronal, ha atraído un interés considerable debido a su posible importancia terapéutica en el tratamiento de diversas enfermedades neurodegenerativas. El papel de las señales extracelulares en la determinación de la diversidad del sistema nervioso en vertebrados se ha estudiado de forma extensiva. Los factores secretados mejor caracterizados implicados en el control del desarrollo y en el sistema nervioso de adultos son las familias del factor de crecimiento nervioso (FCN, NGF por sus siglas en inglés “nerve growth factor”) y el factor neurotrófico derivado de una línea celular gliar (GDNF, siglas en inglés) de los factores neurotróficos (revisado en Bibel y Barde, 2000, Genes Dev 14:2919-2937; Airaksinen et al. 1999, Mol Cell Neurosci 13:313-325; Airaksinen y Saarma, 2002, Nat Rev Neurosci 2002, 3:383-394). Estos factores neurotróficos promueven la supervivencia, la diferenciación y el mantenimiento de poblaciones neuronales específicas en vertebrados. Posteriormente, se ha demostrado que tienen otras funciones importantes, incluyendo la regulación de la

25 plasticidad sináptica dependiente de la actividad, la estimulación de la producción de neuritas y la protección y reparación de neuronas durante el daño de los tejidos. El factor promotor de la supervivencia de neuronas dopaminérgicas MANF1 se describe en el documento WO 02/074956. MANF1 es un homólogo de MANF2 (es decir, SEQ ID NO:2) descrito en la presente invención.

30 El documento WO 02/079246 describe una proteína rica en arginina humana, que es un 100 % idéntica a la proteína según SEQ ID NO:2 de la presente invención. Se supone que existe una relación con el cáncer y los inventores proponen usos diagnósticos y terapéuticos de la proteína y la secuencia de ácido nucleico codificante.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe una nueva proteína del factor neurotrófico, MANF2 y una secuencia genética que codifica a la misma. La molécula será útil en el desarrollo de una variedad de agentes terapéuticos y diagnósticos útiles en el tratamiento, la profilaxis y/o el diagnóstico de afecciones dependientes de MANF2. La molécula de la presente invención es también un efector útil de neuronas primarias y centrales.

Recientemente, se ha identificado un nuevo factor neurotrófico humano, el factor neurotrófico derivado de astrocitos mesencefálico (MANF1, denominado en este 10 documento MANF1) y se ha demostrado que protege la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas embrionarias en cultivo (solicitud de patente WO0119851). MANF1 es una proteína secretada de 20 kD sin una homología significativa respecto a otras familias de proteínas conocidas. Las propiedades in vitro de MANF1 sugieren que pudiera ser usada para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y posiblemente, para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas. El amplio modelo de expresión de MANF1, sin embargo, (Shridhar et al., 1996, Oncogene 12:1931-1939) también sugiere que puede tener otras funciones aún no descubiertas fuera del sistema nervioso, y efectos en muchos tipos de células diferentes.

20 MANF1 es, por lo tanto, una molécula importante que la hace una diana potencialmente valiosa para la investigación en agentes terapéuticos, profilácticos y diagnósticos basados en MANF1 o sus actividades. Queda también una necesidad de identificar homólogos o, por otro lado, moléculas relacionadas para uso como una alternativa a MANF1 o junto con MANF1.

25 Con el trabajo que se ha llevado a cabo hasta el momento en la presente invención, los inventores han descubierto una nueva molécula llamada MANF2 que es un nuevo factor de crecimiento relacionado con MANF1.

En consecuencia, un aspecto preferido de la presente invención comprende una molécula proteica aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 30 NO:2 de la FIGURA 7 o sus fragmentos funcionales. En todavía otro aspecto preferido de la invención se proporciona la molécula en su forma recombinante. La molécula aislada o recombinante de la presente invención puede estar glicosilada de forma natural o puede comprender un modelo de glicosilación

modificado según qué células se aíslen o sinteticen. Por ejemplo, de ser producida por medios recombinantes en organismos procariotas, la molécula no estaría glicosilada. También se describen composiciones farmacéuticas del polipéptido de MANF2 opcionalmente formuladas. Las composiciones del polipéptido de la presente invención pueden comprender además a un vehículo aceptable, tal como un vehículo hidrófilo, p.ej., farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones son útiles en el tratamiento de condiciones dependientes de MANF2.

Un aspecto preferido son los anticuerpos que se unen específicamente a MANF2. Los anticuerpos preferidos son anticuerpos monoclónicos que no son 10 inmunógenos en los seres humanos. Los anticuerpos preferidos se unen a MANF2 con

una afinidad de al menos aproximadamente 10-6 M, más preferentemente 10-7 M.

Además de lo anterior, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, vectores de expresión y células huésped que codifican a MANF2 que pueden usarse en la producción recombinante de MANF2 según se describe en este documento. Las moléculas de ácido nucleico aisladas y los vectores son también útiles para preparar animales transgénicos no humanos y para aplicaciones de terapia génica para tratar a pacientes con defectos de MANF2.

La molécula MANF2 de la presente invención será útil en el desarrollo de una variedad de aplicaciones terapéuticas y/o diagnósticas simples o en combinación con 20 otras moléculas tales como MANF1. La presente invención abarca, por lo tanto, a composiciones farmacéuticas que comprenden la molécula de MANF2 o sus fragmentos funcionales junto con uno o varios vehículos farmacéuticamente aceptables y/o diluyentes. Además, la presente invención abarca a vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:1 de la FIGURA

25 7 y las células huésped que comprenden al mismo. Otro aspecto más de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de MANF2 descrita en este documento. Más particularmente, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como la expuesta en SEQ ID NO:1 de la

30 FIGURA 7. Aunque puedan usarse otros métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o análisis de la presente invención, los métodos y materiales adecuados son los descritos a continuación. Los materiales, los métodos y los ejemplos son sólo ilustrativos y no se tiene pretende que sean restrictivos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de MANF2 y MANF1 en Homo sapiens. El alineamiento fue generada con el programa ClustalX. Los residuos de aminoácidos idénticos son marcados con asterisco; según las características fisicoquímicas de los residuos, la similitud alta está marcada con dos puntos dobles y de forma similar con un punto. Las secuencias señal están subrayadas. Los motivos de hélice alfa de la estructura secundaria son conservados entre MANF1 y MANF2 y se marcan por encima de las secuencias. También están

10 marcadas las ocho cisteínas conservadas (encuadradas). FIGURA 2. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de MANF2 en Homo sapiens y Mus musculus. Para las explicaciones de los símbolos, véase la FIGURA 1. FIGURA 3. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de MANF de organismos seleccionados. Las secuencias fueron adquiridas realizando búsquedas Blast en el servidor de la página del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nlh.gov). En algunos casos, la secuencia...

1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ

5 ID NO:2 o su fragmento funcional para uso en terapia génica de una neuropatía periférica.

2. El ácido nucleico purificado y aislado para uso en terapia génica de una

neuropatía periférica según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de 10 nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.

3. El ácido nucleico purificado y aislado para uso en terapia génica de una neuropatía periférica según la reivindicación 1, en el que dicha neuropatía periférica es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

4. El ácido nucleico purificado y aislado para uso en terapia génica de una neuropatía periférica según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento funcional es un polipéptido de MANF2 sin un péptido señal, en el que dicho punto de corte de la secuencia señal está entre los aminoácidos de la posición 26 y 27 de SEQ ID NO:2.

15

20

5. Un constructo de expresión que comprende el ácido nucleico que se define en la reivindicación 1, operativamente unido a una secuencia de control de la expresión, siendo dicho constructo de expresión capaz de codificar un polipéptido de MANF2 o sus fragmentos funcionales para uso en terapia génica de una neuropatía

25 periférica.

6. El constructo de expresión para uso en terapia génica de una neuropatía periférica según la reivindicación 5, en el que dicha neuropatía periférica es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

30

7. Un polipéptido de MANF2 aislado y purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su fragmento funcional para uso en el tratamiento de una neuropatía periférica.

8. El polipéptido de MANF2 aislado y purificado para uso en el tratamiento de una neuropatía periférica según la reivindicación 7, en el que dicha neuropatía periférica es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

5 9. El fragmento funcional de un polipéptido de MANF2 para uso en el tratamiento de una neuropatía periférica según la reivindicación 7, en el que dicho fragmento funcional es un polipéptido de MANF2 sin un péptido señal, en el que el punto de corte de la secuencia señal está entre los aminoácidos en la posición 26 y 27 de SEQ ID NO:2.

10

10. El uso de un animal transgénico no humano que contiene el gen de MANF2 humano o murino expuesto en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 como un transgen para analizar reactivos que se piensan que confieren protección de una neuropatía periférica, en el que dicho animal es tratado con el reactivo, y la frecuencia reducida de

15 la enfermedad, comparado con animales no tratados que llevan el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial para la neuropatía periférica.

11. El uso de un animal transgénico no humano que contiene un transgen o una inserción que rompe la expresión de un gen de MANF2 expuesto en SEQ ID NO:

20 1 o SEQ ID NO:3 para caracterizar la capacidad de dicho animal transgénico no humano de imitar una neuropatía periférica.

12. Un compuesto farmacéutico que comprende la proteína MANF2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su fragmento funcional, o

25 la molécula de ácido nucleico de MANF2 expuesta en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, para uso en el tratamiento de una neuropatía periférica.

13. El compuesto farmacéutico para uso en el tratamiento de una neuropatía periférica según la reivindicación 12, en el que dicho fragmento funcional es un

30 polipéptido de MANF2 sin un péptido señal, en el que el punto de corte de la secuencia señal está entre los aminoácidos en la posición 26 y 27 de SEQ ID NO:2.

14. El compuesto farmacéutico para uso en el tratamiento de una neuropatía

periférica según la reivindicación 12, en el que dicha neuropatía periférica es la 35 enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.