Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la producción de alcaloides indólicos.

Composición que comprende ciclodextrinas y jasmonato de metilo, y método para incrementar la producción de alcaloides indólicos en cultivos de células vegetales, tejidos de plantas, vitroplantas y plantas que son capaces de sintetizar estos compuestos, excretarlos y acumularlos en el medio de cultivo

Uso combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la producción de alcaloides indólicos.

La presente invención se encuentra dentro de la biología y de la biotecnología, y se refiere al empleo de una composición que comprende ciclodextrinas y jasmonato de metilo para incrementar la producción de alcaloides indólicos en cultivos de células vegetales, tejidos de plantas, vitroplantas y plantas que son capaces de sintetizar estos compuestos, excretarlos y acumularlos en el medio de cultivo.

Estado de la técnica anterior

Los alcaloides son uno de los grupos más diversos de metabolitos secundarios encontrados en los organismos vivos, aislándose tradicionalmente de las plantas, de las cuales alrededor del 20% los contienen, pero encontrándose también en animales, insectos, invertebrados marinos y microorganismos. De los aproximadamente 12000 alcaloides conocidos, una gran cantidad han sido empleados en la medicina, y muchos de ellos aún son prominentes fármacos hoy en día. De acuerdo con su origen biogenético se clasifican en cuatro grupos:

Dentro del grupo de los alcaloides derivados del triptofano se encuentran los indólicos (que se pueden agrupar, a su vez, en monoterpernos o indol terpenos (iridoides)) y los quinoleínicos. La mayor parte proceden de la triptamina, producto de la descarboxilación del triptofano, que se une en casi todos los casos a otras unidades como son las unidades acetato, mevalonato, secologanósido (aldehído monoterpénico) y otras. Podemos por tanto hablar de varios subgrupos dentro de los alcaloides indólicos. Así, desde un punto de vista químico se pueden reconocer 8 subgrupos: corinante, aspidosperma, iboga, estricnano, plumerano, eburnano, valesiacontamano y aparicino. Otra posible clasificación sería:

Los alcaloides indolmonoterpénicos ó monoterpén indólicos (AMIs) conforman una familia de más de 3.000 miembros, encontrándose en varias familias vegetales, pero principalmente en las Apocynaceae, Loganiaceae, Nissaceae y Rubiaceae, todas del orden Gentianales. Los AMI's se forman a partir del triptofano y de la secologanina, un derivado del isopentenil pirofosfato. El interés en ellos se debe a que algunos, específicamente la catarantina y la vindolina, pueden formar dímeros citotóxicos que se utilizan en los tratamientos contra diferentes tipos de cánceres.

Catharanthus roseus (L.) G. Don es una planta perenne de la familia de las Apocinaceas de distribución pantropical originaria de Madagascar, capaz de biosintetizar más de 130 metabolitos secundarios de naturaleza alcaloide, usada en la medicina tradicional como agente hipoglucémico, siendo además una fuente importante de agentes quimioterapéuticos con actividad anticancerígena, y que produce una gran variedad de AMIs, la mayoría de los cuales poseen actividad farmacológica, se cultiva para obtener industrialmente, a partir de sus hojas, los alcaloides anticancerígenos vincristina, vinblastina y anhidrovinblastina mientras que sus raíces se utilizan como materia prima para la extracción de los alcaloides serpentina y ajmalicina, prescritos para los tratamientos de hipertensión y desordenes circulatorios (Karthikeyan et al., 2007. Journal of Zhejiang University - Science B 8(7): 453-457) Jaleel & Panneerselvam, 2007. Chin J Pharm Tox 21, 6, 487-494). Estos metabolitos se extraen de los diferentes tejidos de esta planta y las rutas biosintéticas que conducen a su obtención se conocen y están bien descritas en la bibliografía (El-Sayed M & Verpoorte R, 2007. Photochem. Photobiol 6(2-3): 277-305). La principal demanda de hojas la realiza Estados Unidos y Reino Unido que movilizan más de 100 toneladas anuales mientras que Alemania se interesa por la compra de las raíces (Acosta y Rodríguez, 2002, Instructivo técnico para el cultivo de Catharanthus roseus (L.) G. Don. Rev. Cubana Plant. Med. 7, 96-99).

Entre los alcaloides más importantes producidos por C. roseus están los del tipo bis-indólico que incluyen a la vinblastina, utilizada en el tratamiento del mal de Hodgkin, y a la vincristina empleada en el tratamiento de la leucemia; esta planta también produce los agentes antihipertensivos ajmalicina y serpentina utilizados contra las arritmias cardiacas y el mejoramiento de la circulación cerebral.

Los alcaloides más importantes desde el punto de vista económico son la vinblastina y la vincristina. En la actualidad, estos compuestos se obtienen mediante un proceso extractivo de la materia prima vegetal ya que no existen preparados sintéticos que puedan reemplazar la potente acción antineoplásica que exhiben la vincristina y la vinblastina. Este proceso de extracción es de baja productividad (rendimiento) ya que a partir de 2 toneladas de hojas se recoge 1 gramo de alcaloide activo, cantidad requerida para el tratamiento de un niño con leucemia o linfosarcoma durante seis semanas (Cuellar et al., 1975. Rev. Cubana Farm. 9, 183-199). El precio de la vinblastina en el mercado es de aproximadamente un millón de dólares por kilogramo, calculándose que existe una producción anual de 12 Kg. Por otra parte, la vincristina alcanza un precio de 3.5 millones de dólares por kilogramo y su producción anual es de aproximadamente 1 kilogramo. El alto costo de estos alcaloides se debe a que encuentran en concentraciones muy bajas en la planta (alrededor de 0.0005% en peso seco) y su extracción se lleva a cabo en presencia de otros 200 alcaloides con propiedades químicas y físicas similares (De Luca & Laflamme, 2001. Curr. Opi. Plant Biol. 2001, 3, 225-233). La complejidad de los procesos genéticos, catalíticos y de transporte de la biosíntesis de los alcaloides monoterpénicos indólicos hace difícil la obtención de estos compuestos.

Otro método para la obtención de estos compuestos y que ha resultado tener cierto éxito es el de semi-síntesis mediante el acoplamiento de los precursores vindolina (muy abundante en las plantas de C. roseus) y catarantina (que puede alcanzar niveles altos en cultivos celulares de C. roseus) dando lugar a la vinblastina. Pero para sintetizarlos de novo hace falta la intervención de más de 50 pasos metabólicos, habiéndose caracterizado hasta el momento solamente unas 20 enzimas de las 50 requeridas para su biosíntesis.

La biosíntesis de los alcaloides bis-indólicos se inicia con la condensación de la catarantina y la vindolina, para formar la 3',4'-anhidrovinblastina, el precursor de la vinblastina, la vincristina, la leurosina y la Catarina. Esta reacción, al igual que la oxidación posterior, parece ser llevada a cabo por peroxidasas inespecíficas, lo que parece indicar que la limitante de la biosíntesis de este tipo de alcaloides resulta ser la disponibilidad de los precursores monoméricos.

1. Método de obtención de alcaloides indólicos, que comprende:

2. Método según la reivindicación anterior, donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos son células vegetales procedentes de plantas del orden Gentianales.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos son células vegetales procedentes de plantas que se seleccionan de las siguientes familias: Apocynaceae, Loganiaceae, Nissaceae y/o Rubiaceae.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos son células vegetales procedentes de plantas del género Catharanthus.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos son células vegetales procedentes de C. roseus.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos proceden de vitroplantas.

7. Método según la reivindicación anterior, donde las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos proceden de las hojas de las vitroplantas.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la concentración de jasmonato de metilo es de entre 5 y 500 micromoles/ litro de medio de cultivo.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la concentración de jasmonato de metilo es de entre 25 y 150 micromoles/ litro de medio de cultivo.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la concentración de jasmonato de metilo es de entre 75 y 125 micromoles/ litro de medio de cultivo.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde las ciclodextrinas se seleccionan del grupo que comprende cliclodextrina metilada aleatoriamente o ciclodextrina hidroxipropilada.

12. Método según la reivindicación 11 donde la ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de sustitución por metilos de entre 1 y 3.

13. Método según la reivindicación 11 donde la ciclodextrina metilada aleatoriamente es dimetilada.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la ciclodextrina es una β-ciclodextrina.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde la concentración de ciclodextrinas es de entre 6.5 y 130 g/L medio de cultivo a).

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 donde la concentración de ciclodextrinas es de entre 10 y 100 g/L medio de cultivo a).

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 donde la concentración de ciclodextrinas es de entre 50 y 75 g/L medio de cultivo a).

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 donde la concentración de células de b) en el medio a) es de entre 10 g de peso fresco/litro, 1 g de peso seco/litro y 400 g de peso fresco/litro, 20 g de peso seco/litro.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 donde la concentración de células de b) en el medio a) es de entre 75 g de peso fresco/litro, 4 g de peso seco/litro y 300 g de peso fresco/litro, 15 g de peso seco/litro.

20. Método según la reivindicación 19 donde la concentración de células de b) en el medio a) es de entre 100 g de peso fresco/litro, 5 g de peso seco/litro y 250 g de peso fresco/litro, 10 g de peso seco/litro.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde el medio de cultivo que comprende las ciclodextrinas, el jasmonato de metilo y las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos se someten a radiación UV.

22. Método según la reivindicación anterior, donde los donde el medio de cultivo que comprende las ciclodextrinas, el jasmonato de metilo y las células potencialmente productoras de alcaloides indólicos se someten a radiación UV durante tiempos cortos de entre 5 y 30 minutos.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 donde el porcentaje de saturación de oxígeno en el medio de cultivo es de entre 40% y un 100%.

24. Composición que comprende jasmonato de metilo y ciclodextrinas.

25. Uso de la composición de la reivindicación 24 para promover la producción de alcaloides indólicos en células productoras de los mismos.

26. Uso combinado de metil-jasmonato y ciclodextrinas para promover la producción de alcaloides indólicos en células productoras de los mismos.