Grupo de genes NRPS-PKS, su manipulación y su utilidad.

Una molécula de ácido nucleico que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID Nº 1;

o

(b) una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la SEC ID Nº 1; o

(c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % (preferentemente una identidad de secuencia de al menos 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) con la SEC ID Nº 1; o

(d) una parte de una cualquiera de (a) a (c), en la que dicha parte comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos como se muestra en una cualquiera de las SEC ID Nº 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 3 8, 40 o 44 o una secuencia de nucleótidos que es complementaria de las mismas o que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % con las mismas; o

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEC ID Nº 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 45 o que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % (preferentemente al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) con las mismas, en la que dicha molécula de ácido nucleico codificaones complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos que tienen actividad funcional en la síntesis de BE-14106.

Grupo de genes NRPS-PKS, su manipulación y su utilidad

La pr esente in vención se r efiere a la c lonación y s ecuenciación d el grupo de genes que c odifica I a maq uinaria biosintética para la síntesis de la macrolactama policétido BE-1416, que incluye tanto un dominio de adenilación de péptido sintetasas no ribosomales (NRPS) como una enzima biosintética o complejo enzimático policétido modular (PKS; enzima o complejo enzimático policétido sintasa). La maquinaria para la biosí ntesis comprende por tanto un sistema enzimático NRPS-PKS híbrido. Por consiguiente, la invención se refiere a nuevos genes y a moléculas de ácido nucleico que codifican la maquinaria biosintética para la sí ntesis de la macrolactama BE-1416, que incluye una enzima biosintética o un sistema enzimático NRPS-policétido modular que interviene en la biosíntesis de BE- 1416 y a la maquinaria biosintética que incluye el propio sistema o co mplejo enzimático NRPS-policétido sintasa modular (así como sus componentes). Adicionalmente, la invención se refiere al uso de estos genes, a moléculas de ácido nucleico, a la maquinaria, a enzimas y a sistemas enzimáticos o complejos de los mismos, que facilitan tanto la biosíntesis de BE-1416 como la síntesis de derivados de BE-1416 y nuevas estructuras macrolactama.

Los policétidos, o estructur adas reí acionadas o b asadas en policétidos, son, o for man I a b ase de, productos naturales sintetizados por ba cterias, hongos, plantas y animales, muchos de los cualestienen la posibilidad de aplicarse como agentes farmacéuticos o como pro ductos agrícolas o veterinarios, por ejemplo, como antibióticos, antifúngicos, citostáticos, anticolesterolémicos, antiparasitarios, coccidiostáticos, y promotores de crecimiento animal e Insecticidas naturales.

Las bacterias Streptomyces gram positivas son las principales productoras de policétidos y de moléculas basadas en policétidos y la genética y la bioquímica de la biosíntesis de policétidos en estos organismos están relativamente bien caracterizadas (McDanlel R, et al., Chem Rev. 25 Feb; 15(2): 543.58).

Otros productores Incluyen otros actlnomlcetos. Se conoce una serie de diferentes moléculas basadas en policétidos (o relacionadas con policétidos), cuyas macrolactamas representan una clase. Ogasawara Y. ef a/; Chem Biol. Ene 24; 11(1): 79-98 y Udwary et al] Proc Nati Acad Sci USA, 19jun 27; 14(25): 1376-81, respectivamente, han descrito los grupos de genes biosintéticos para la síntesis de las macrolactamas vicenistatina y salinilactama.

BE-1416 (nombre alternativo GT-32A) es un antibiótico de macrolactama que tiene una estructura química como se expone en la Figura 1. Se ha aislado de una cepa de Streptomyces spheroides y se ha observado que tiene efectos citotóxicos e n líneas d e cél ulas de le ucemia, así como actividad antimicrobiana contra una s erie de orga nismos ensayados, actividad antiproliferativa contra una línea de células BALB3T3 transformada mediante H-ras y actividad inhibidora contra la reacción linfocitaria mixta (documento JP41179, Kojiri et al 1992 Journal of Antibiotics, 868-74, Takahashi et al 1997, Journal of Antibiotics 186-8). También se ha aislado un análogo 8-desoxi (GT-32B) de una especie de Streptomyces n o esp ecificada y s e observó que comp artía much as d e las activi dades de BE-1416 (Takahashi et al, citados anteriormente).

Los compuestos de macrolactama, tales como BE-1416, puede formarse mediante activación y cebado del sistema PKS con un aminoácido activado y la extensión del resto aminoacídico (cadena aminoacilo) por condensaciones repetidas de ácidos carboxílicos simples por policétido sintasas (PKS) de manera similar a la bi osíntesis de ácidos grasos. Porta nto, a diferencia del caso con una simple cadena de policétido en el q ue la "unidad iniciadora" es u n resto de áci do carboxílico, en este caso, I a unidad iniciadora para la P KS es un prod ucto intermedio aminoacilo sintetizado a partir de un aminoácido y de una cadena acilo. Las PKS pueden organizarse como PKS repetitivas que re-utilizan dominios en una manera cíclica o como PKS modulares (de Tipo I) que c ontienenuna secuencia de módulos (o u nidades repetidas) distintos y no r e-utilizan dominios. Cada módulo es responsable de un ciclo de condensación en la síntesis de la cadena del policétido y contiene diversos dominios enzimáticos. En el caso de BE- 1416 la cadena "policetídica" es, estrictamente ha blando, una cadena de aminoácidos - policetídica híbrida, o una cadena amin oacilo, per o en el prese nte docum ento se denomina "c adena policetídica". Portant o, ad emás de dominios p ara la con densación de I s iguiente ác ido car boxílico so bre la cad ena del policétido en cree imiento, catalizada por el dominio de la p-cetoacil sintasa (KS), los módulos de la PKS de tipo I pueden contener dominios con actividades p-cetorreductasa (KR), deshidratasa (DH) o enoil reductasa (ER), que determinan el estado reducido de unidades extendedoras incorporadas. Los dominios de la acetiltransferasa (AT) y de la proteína transportadora de acilos (ACP, Acyl C arrier P rotein) pres entes ene ada módulo s on r esponsables déla elección de la un idad extendedora y de la conservación de la cadena del policétido en crecimiento en la PKS, respectivamente. Después de finalizar la síntesis, la cadena del policétido se libera de las PKS mediante la acción de una tioesterasa (TE), que también está probablemente implicada en la delación del producto final. Por tanto, las PKS de tipo I representan una línea de ensamblaje para la biosíntesis de policétidos, que puede manipularse cambiando el número de módulos, sus especificidades hacia los ácidos carboxílicos e inactivando o inserta ndo domi nios con actividades reductoras (Weissman y Leadlay, Nat. Rev. Microbiol. 25 Dec; 3(12): 925-36). Desp ués de que la fracción policétido se sintetiza y cic la par a forma r un an ¡lio de macrolacto na (o macrol actama), esta pu ede mo dificarse medi ante hidroxilación, gluc osilación, metilación y/o acil ación. Estas modific aciones pueden ser imp ortantes para las actividades biológicas de determinados productos basados en policétidos. Como se describirá con más detalle más adelante, en el trabajo que conduce a la presente invención, los genes que codifican el sistema enzimático NRPS-

PKS de B-1416 (el"grupo de genes" de BE-1416)se han clonado ysecuenciado y se ha determinado q ue el sistema enzimático NRPS-PKS de BE-1416 contiene diversas PKS de tipo I, cada una de las cuales se organiza de manera modular y está constituida por unidades repetidas (módulos).

Los genes para la biosí ntesis de policétidos en Streptomyces se organizan generalmente en grupos, y diversos de dichos grupos ya identificados son los responsables déla síntesis de diversos productos naturales. La clonación molecular y secuenciación completa de ADN de diversos grupos de genes antibióticos macrólidos de Streptomyces se ha descrito, incluyendo los de la avermectina, pikromicina y rapamicina (Ikeda H., Omura S. (22). Biosynthesis, Regulation, and Genetics of Macrolide Production. In: Macrolide Antibiotics: Chemistry, Biology and Practice, 2a Ed. (ed. S. Omura), págs. 286-326, Academic Press, Nueva York). Como se ha mencionado anteriormente, también se han notificado grupos de genes para los biosistemas de determinados antibióticos de macrolactama.

Como s e ha indicado a nteriormente y co mo se describe más adelante, la presente inv ención s e b asa en la identificación, clonación y secuenciación de un nuevo grupo de gen es para la biosíntesis de BE-1416 que hasta ahora no estaba dis ponible. Adicio nalmente, el aná lisis de los g enes clona dos h a permití do a clarar I a rut a biosintética de BE-141 6. Por consiguiente ahora se pr opone que el proceso normal de síntesis de BE-1416se inicia a través de la síntesis d e una unidad iniciadora (C17-C25), en la q ue una fracción acilo se sintetiza a partir de 1 unidad de propionato y 2 de acetato. La síntesis de la unidad iniciadora continúa con la activación de una molécula de g licina me diante un dominio de adenilación NRP S y car gando la gl icina ac tivada s obre una proteína transportadora peptidilo. La desam inación oxidativa de I a g licina li bera am oniaco, lo q ue constit uye u n ataque nucleófilo en el carbonilo C-17 para formar un grupo imino C-17, que posteriormente se reduce a un grupo amino. La liberación déla cade na am inoacilo d e la proteína tra nsportadora p eptidilo, prod uce la formad ón de un ác ido carboxílico, q ue después se adenila y se liga con la co enzima A (CoA). La am inoacil-CoA activada resultante se transfiere a I d ominio ACP d e una PKS m ediante u na a ciltransferasa y se e xtiende y mod ifica p or la acci ón... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende:

(a) una secuencia de nucleótldos como se muestra en la SEC ID N° 1; o

(b) una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la SEC ID N° 1; o

(c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % (preferentemente una identidad de secuencia de al menos 87 %, 9 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) con la SEC ID N° 1; o

(d) una parte de una cualquiera de (a) a (c), en la que dicha parte comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos como se muestra en una cualquiera de las SEC ID N° 2, 6, 8, 1, 12, 14, 16, 18, 2, 22, 24, 26, 28, 3, 32, 34, 36, 38, 4 o 44 o una secuencia de nucleótidos que es complementaria de las mismas o que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % con las mismas; o

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEC ID N° 3, 7, 9, 11, 13, 1 5, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 3 3, 35, 37, 39, 41 o 45 o que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % (preferentemente al menos 9 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) con las mismas,

en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica o es complementarla a una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos que tienen actividad funcional en la síntesis de BE-1416.

2. La molécula de ácid o nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha molécula codifica un sistema biosintético NRPS-PKS para la síntesis de BE-1416.

3. Un pollpéptldo codificado por una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 o 2, en el que dicho pollpéptldo comprende:

(a) la totalidad de una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera o más de las SEC ID N° 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41 o 45; o

(b) la totalld ad de una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al me nos 85 % co n una cualquiera o más de las SEC ID N°3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 45, preferentemente al menos una identidad de secuencia del 87 %, 9 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, en el que dicho polipéptido tiene una actividad funcional en la síntesis de BE-1416.

4. El uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 o 2 en la preparación de un grupo de genes biosintéticos de BE-1416 para la preparación de una molécula de BE-1416 modificada.

5. Un método de preparación de una molécula de ácido nucleico que codifica un sistema NRPS-PKS modificado de BE-1416, comprendiendo dicho método modificar una molécula de ácido nucleico que codifica dicho sistema NRPS-NKS de BE-1416 y que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID N° 1; o

(b) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % (preferentemente una identidad de secuencia de al menos 87 %, 9 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) con la SEC ID N° 1; o

(c) una parte de (a) o (b).

6. El método de la reivindicación 5 en el que dicha molécula de ácido nucleico se modifica introduciendo, mutando, delecionando, reemplaz ando o inactiva ndo un a secuencia que codifica una o más actividades o proteínas codificadas por dicha molécula de ácido nucleico.

7. El método de la reivindicación 5 o 6 en el que se modifica una o más de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de:

(i) una secuencia de nucleótidos como se muestra en una cualquiera de las SEC ID N° 2, 4, 6, 8, 1 , 12, 14, 16, 18, 2, 22, 24, 26, 28, 3, 32, 34, 36, 38, 4, 42 o 44; o

(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % con una secuencia de nucleótidos como se muestra en una cualquiera de las SEC ID N° 2, 4, 6, 8, 1, 12, 14, 16, 18, 2, 22, 24, 26, 28, 3, 32, 34, 36, 38, 4, 4 2 o 44 y que codifica un polipéptido que tiene actividad funcional en la síntesis de BE- 1416; o

(iii) una secuencia de nucleótidos que es complementaria de (i) o (ii).

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en el que dicha molécula de ácido nucleico se modifica de una o más de las siguientes maneras:

(i) modificación de una secuencia que codifica una PKS para modificar un dominio de un módulo de carga para alterar la naturaleza de la unidad iniciadora;

(ii) modificación de u na secuencia que codifica una PKS para modificar el número de módulos, preferentemente para disminuir el número de módulos;

(iii) modificación de una secuencia que codifica u na PKS para modificar un dominio AT para alterar su especificidad por una unidad extendedora;

(iv) modificación de una secuencia que codifica una PKS para alterar la actividad de un dominio de deshidratasa (DH) o de cetorreductasa (KR), preferentemente para ¡nactivar o delecionar un dominio DK o KR;

(v) modificación de una secuencia que codifica una hidroxilasa como se muestra en la SEC ID N°:26 para inactivar la enzima hidroxilasa o alterar su especificidad;

(vi) deleción de una secuencia que codifica una PKS o la modificación de una secuencia que codifica una PKS para inactivar la enzima PKS codificada;

(vii) introducción de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de glucosilación.

9. El método de la reivindicación 8 en el que la modificación de la molécula de ácido nucleico comprende uno o más de:

(i) la deleción o inactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio DH como se expone en la Tabla 3;

(ii) la deleción o inactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio KR como se expone en la Tabla 4;

(iii) la deleción o inactivación de becA como se muestra en la SEC ID N° 5 o de uno de sus módulos;

(iv) la deleción o inactivación de una o más secuencias de nucleótidos que codifican un módulo de BecB, BecD, BecE, BecF o BecG como se define por las posiciones de nucleótidos indicadas en la Tabla 2;

(v) la deleción o inactivación de becO como se muestra en la SEC ID N° 26.

10. El método de una cuaIquiera de Ias reivindicaciones 5 a 9, en el que la molécula de ácido nucleico está endógenamente presente en un microorganismo que produce BE-1416 o uno de sús derivados, y el método se realiza en dich o microorganismo, preferentemente en el q ue dicho microorganismo es Streptomyces sp como el depositado en la DSMZ el 25 de enero de 28 con el número de depósito DSM2169 o uno de sus mutantes o una de sus cepas modificadas que produce BE-1416 o uno de sus derivados.

11. Un método para preparar un sistema NPRS-PKS modificado de BE-14 16, comprendiendo dich o método preparar una molécula de ácido n ucleico modificada de acuerdo co n el método de una cualquiera de Ias reivindicaciones 5 a 1 y expresar dicha molécula de ácido nucleico en un microorganismo.

12. Un método para preparar una molécula de macrolactama; comprendiendo dicho método preparar una molécula de ácido nucleico modificada de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 1 y expresar dicha mol écula de ácido nucleico en un microorganismo, que además comprende preferentemente recuperar la molécula de macrolactama.

13. Una cepa de Streptomyces depositada en Ia DSMZ con el número de depósito DSM21 69 o uno de sus mutantes o una de sus cepas modificadas que produce BE-1416 o uno de sus derivados.

14. Un análogo de BE-1416 que comprende una modificación seleccionada de una cualquiera o más del grupo que comprende, 3-, 5-, 7-, 11-, 13-, 15-, 17- o 23-hidroxi BE-1416, 3-, 5-, 7-, 9-, 11-, 13-, 15-, 17-, o 23-oxo BE-1416 o una de sus combinaciones o un análogo que comprende una combinación de un grupo 8-desoxi con una o más modificaciones seleccionadas de la introducción de un grupo hidroxi u oxo en cualquiera de las posiciones 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17 o 23 o un grupo oxo en la posición 9.

15. Una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 o 2, en la que dicha molécula se ha introducido en una célula hospedadora heteróloga.