TRATAMIENTO DE IMÁGENES, DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD.

La presente invención se refiere a un gen cuya expresión es selectiva para el endotelio y al uso de anticuerpos que se unen al producto de este gen para uso como un medicamento. El endotelio desempeña un papel esencial en muchos procesos fisiológicos y patológicos y se sabe que se trata de un sitio de transcripción excepcionalmente activo. Aproximadamente 1000 genes diferentes se expresan en una célula endotelial. En contraste, se encontró que los glóbulos rojos expresan 8, las plaquetas 22 y el músculo liso 127 genes diferentes (Adams et al, 1995). Algunos genes endoteliales específicos conocidos atraen mucha atención tanto por parte de la investigación básica, como por parte de la comfracción clínica. Por ejemplo, las tirosina quinasas específicas endoteliales Tie, TIE2/TEK, KDR y flt1 desempeñan papeles cruciales en la regulación de la integridad vascular, los procesos inflamatorios mediados por el endotelio y en la angiogénesis (Sato et al, 1993, Sato et al, 1995, Fong et al, 1995, Shalaby et al, 1995, Alello et al, 1995). Se reconoce ampliamente a la angiogénesis en la actualidad como un proceso que limita el crecimiento de tumores sólidos. También se encuentra involucrado en la formación de las placas de ateroesclerosis y restenosis. Por último, el endotelio desempeña un papel esencial en el complejo y dinámico sistema que regula la coagulación y la hemostasis. De los muchos genes diferentes que se expresan en una célula endotelial, no todos son completamente selectivos de las células endoteliales, de modo que los genes y sus productos, y las moléculas que se unen a ellos por lo general no resultan útiles para las imágenes, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. Por tanto, existe aún la necesidad de encontrar moléculas específicas o selectivas de las células endoteliales. En este documento reportamos la identificación de dos genes endoteliales altamente selectivos a los que hemos llamado: molécula 1 específica de células endoteliales (ECSM1) y glorieta mágica (molécula 4 específica de células endoteliales; ECSM4), aunque la presente invención se relaciona, únicamente, con ECSM4 humano. El término ECSM4 se emplea para indicar, como lo dejará claro el contexto, el ADNc y los polipéptidos codificados por el gen. ECSM4 es sorprendentemente específico en su perfil de expresión celular, y muestra una selectividad por las células endoteliales que es similar a la de el marcador aceptado actualmente en la técnica como el mejor marcador de células endoteliales (Factor von Willibrand). Obviamente, un grado tan elevado de especificidad por las células endoteliales es tan inédito como inesperado. El clon de ADNc de la glorieta mágica humana (ECSM4), con una ORF de más de 417 aa (Número de Acceso de GenBank AK000805) y descrito en WO 99/46281 como una secuencia de 3716 nucleótidos se identificó mediante búsquedas de BLAST contra el contig 111518. Esta secuencia es rica en prolinas y presenta varias regiones de baja complejidad aminoacídica. La búsqueda de BLAST contra PRODOM (base de datos de familias de proteínas en HGMP, UK) identificó una región de 120 pb con homología con el dominio citoplasmático conservado de la familia de receptores de transmembrana involucrados en la guía repulsiva del axón (familia de proteínas ROBO1 DUTT1, E=4e-07). La homología se extendió a 468 aa (E=1,3e-09) cuando se llevó a cabo un análisis más riguroso empleando ssearch (Smith y Waterman, 1981), pero la región de similitud seguía contenida aun en el dominio citoplasmático. La familia ROBO1 DUTT1 incluye el homólogo 1 de la glorieta humana (ROBO1), el gen de ratón DUTT1 y el gen de rata ROBO1 (Kidd et al, 1998, Brose et al, 1999). Debido a esta región de homología llamamos al gen representado por Hs. 111518 glorieta mágica (ECSM4). Además el BLAST SBASE (base de datos de dominios de proteínas en HGMP) sugirió una región de similitud con el dominio largo del precursor de la molécula intracelular de adhesión de células neurales (E=2e-11). Debe resaltarse que el verdadero producto proteico de la glorieta mágica es probablemente más largo que los 417 aa codificados por el clon AK000805, dado que aparentemente la ORF no tiene un límite upstream (sentido hacia arriba), y la comparación de tamaño con la glorieta humana 1 (1651 aa) sugiere que se trata de una proteína mucho mayor. Esto está confirmado por la Figura 3, que muestra que el producto de traducción del gen ECSM4 de humanos tiene alrededor de 118 kDa. Sin embargo, ECSM4 es más pequeña que otros miembros de la familia de las glorietas, con los que comparte sólo dos de los cinco dominios Ig y dos de los tres dominios de tipo fibronectina en la región extracelular. La probable región intracelular rica en prolina que es homóloga a las de las glorietas que se piensa que se unan a c-abl. La Figura 12 muestra la secuencia aminoacídica completa de la ECSM4 humana (1105 aa), y la secuencia del homólogo de ratón se muestra en la Figura 13. En WO 99/11293 y WO 99/53051 se presentan secuencias nucleotídicas codificantes, que muestran alrededor de 99% de identidad con la secuencia nucleotídica de ECSM4 dada en la Figura 12. En EP 1 074 617, WO 00/53756, WO 99/46281, WO 01/23523 y WO 99/11293 se presentan otras secuencias que muestran homología con la secuencia polipéptidica o nucleotídica de ECSM4. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones revela que estas secuencias se expresen de manera selectiva en el endotelio vascular, ni sugieren tampoco que puedan ser expresadas de esa forma. Recientemente se han descubierto asociaciones interesantes entre los genes de la diferenciación neuronal y los de las células endoteliales. Por ejemplo, se identificó un receptor neuronal para el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) neuropilin 1 (Soker et al, 1998). La creencia tradicional era que VEGF era un factor de crecimiento exclusivo del endotelio. Procesos similares a la guía de los axones neuronales se implican ahora en la guía de la migración de las células endoteliales durante la angiogénesis y el crecimiento de los capilares. Por tanto, los ligandos efrinB y los receptores de EphB están involucrados en la demarcación de los dominios arterial y venoso (Adams et al, 1999). Es posible que la glorieta mágica 2   (ECSM4) sea un homólogo específico del endotelio de la glorieta humana 1 involucrada en la guía repulsiva de las células endoteliales, presumiblemente con un ligando diferente, dado que la similtud está confinada a la región citoplasmática, o sea, efectora y se sabe que los receptores de guía poseen una arquitectura altamente modular (Barshaw y Goodman, 1999). Sin embargo, hasta el momento no ha habido ninguna mención a la existencia de una contraparte endotelial, ni a que el patrón de expresión del gen de la glorieta mágica (ECSM4) se encuentre restringido a las células endoteliales, en especial a las células endoteliales angiogénicas, ni a ninguna función del polipéptido codificado por dicho gen. Debe señalarse que un resultado sorprendente de nuestro análisis de RT-PCR, descrito en el Ejemplo 1 fue que ECSM4 aparentemente muestra una especificidad para el endotelio (Fig. 1) comparable con el marcador endotelial clásico factor de von Willebrand (vWF). La expresión de genes conocidos específicos del endotelio usualmente no se encuentra 100% restringida a la célula endotelial. Los datos presentados en este documento muestran el muy inesperado hallazgo de que ECSM4 no se expresa a niveles detectables (al menos mediante el empleo de los métodos descritos en los ejemplos) en tipos celulares distintos de las células endoteliales, dado que la selectividad de los marcadores conocidos de las células endoteliales es inferior al 100%. El análisis de protección con ribonucleasa confirmó y extendió esta observación (Figura 14a). Se observó que la expresión de ECSM4 se restringía al endotelio (tres aislamientos diferentes) y se encontraba ausente de los fibroblastos, las células de carcinoma y las neuronas. KDR y FLT1 se expresan en el tracto reproductivo masculino y femenino: en las células espermatogénicas (Obermair et al, 1999), trofoblastos y en la decidua (Clark et al, 1996). Se ha mostrado que KDR define a las células tronco hematopoiéticas (Ziegler et al, 1999). FLT1 también se encuentra presente en monocitos. Además de las células endoteliales vWF tiene una fuerte presencia en megacariocitos (Sporn et al, 1985, Nichols et al, 1985) y, por consecuencia, está presente en las plaquetas. Del mismo modo, la multimerina se encuentra presente tanto en las células endoteliales (Hayward et al, 1993), como en las plaquetas (Hayward et al, 1998). Hablando de manera general, las células endotelilaes y las células hematopoiéticas descienden de los mismos precursores embrionarios: los hemangioblastos, y estos dos linajes celulares comparten... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo capaz de unir selectivamente al polipéptido humano ECSM4, en el que dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural que comprende una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de la Figura 4 o Figura 5, para uso como un medicamento.. 2. Un anticuerpo según la Reivindicación 1, que liga selectivamente un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica situada entre los residuos 1 y 467 de la secuencia polipeptídica de la Figura 12. 3. Un anticuerpo según la Reivindicación 1 ó 2 que liga selectivamente cualquiera de las secuencias aminoacídicas GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE, o ERATQEEPSEHGP,. 4. Un anticuerpo según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo monoclonal. 5. Un compuesto que comprende (i) un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y (ii) una fracción adicional, para uso como un medicamento. 6. Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional es una fracción fácilmente detectable.. 7. Un compuesto según la Reivindicación 6 en el que la fracción fácilmente detectable comprende un átomo radiactivo. 8. Un compuesto según la Reivindicación 7 en el que el átomo radioactivo es tecnecio-99m o yodo-123. 9. Un compuesto según la Reivindicación 6 en el que la fracción fácilmente detectable comprende una cantidad adecuada de uno cualquiera de yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. 10. Un compuesto según la Reivindicación según la Reivindicación 5, en el que la fracción adicional es una fracción directa o indirectamente citotóxica. 11. Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es un agente quimoterapéutico directamente citotóxico. 12. Un compuesto según la Reivindicación 11, en el que la fracción citotóxica incluye un átomo radioactivo. 13. Un compuesto según la Reivindicación 12 en el que el átomo radioactivo es uno cualquiera entre fósforo-32, yodo-125, yodo-131, indio-111, renio-186, renio-188 o itrio-90. 14. Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es un polipéptido directamente citotóxico. 15. Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es una fracción que es capaz de convertir un profármaco relativamente no tóxico en un fármaco citotóxico. 16. Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es un radiosensibilizador. 17. Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional comprende una molécula de ácido nucleico. 18. Un compuesto según la Reivindicación 17 en el que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico directamente citotóxica. 19. Un compuesto según la Reivindicación 17 en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido directa o indirectamente citotóxico. 20. Un compuesto según la Reivindicación 17 en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido terapéutico. 21. Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional liga selectivamente a una fracción directa o indirectamente citotóxica. 22. Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional liga selectivamente a una fracción fácilmente detectable.   23. Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que el anticuerpo y la fracción adicional son polipéptidos que están fusionados. 24. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un compuesto según la reivindicación 23, para uso como un medicamento. 46                                                 REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción WO 9946281 A [0005] [0006] [0014] [0023] [0118] [0136] WO 9911293 A [0005] [0006] [0014] [0023] [0118] [0136]   WO 9953051 A [0005] EP 1074617 A [0006] [0014] [0023] [0118] [0136] WO 0053756 A [0006] [0014] [0023] [0118] [0136] WO 0123523 A [0006] [0014] [0023] [0118] [0136] WO 99426281 A [0012] WO 9606641 A [0044] US 4348376 A, Goldenberg [0059] WO 9410323 A [0064] US 5180818 A [0067] US 5168053 A [0067] US 5149796 A [0067] US 5116742 A [0067] US 5093246 A [0067] US 4957071 A [0067] EP 0415731 A [0068] EP 0682113 A2 [0186] Literatura no relacionada con patentes citada en la descripción Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851-6855 [0025] Better et al. Science, 1988, vol. 240, 1041 [0026] Skerra et al. 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