Gen que confiere resistencia a Phytophthora infestans (tizón tardío) en solanáceas.

Un ácido nucleico aislado o recombinante, que comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico según se muestra en la figura 6;

o

(ii) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura 8; o

(iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 82% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la figura 8, que comprende un dominio LRR y que es capaz de proporcionar resistencia contra una infección por Phytophthora cuando se incorpora y se expresa en una planta o en una célula vegetal.

Gen que confiere resistencia a Phytophthora infestans (tizón tardío) en solanáceas

El tizón tardío, provocado por el patógeno oomiceto Phytophthora infestans, es la enfermedad más destructiva a nivel mundial en el cultivo de la patata. La enfermedad también amenaza a los cultivos de tomate. La urgencia por obtener cultivares resistentes se ha intensificado a medida que emergen con rapidez cepas del patógeno más virulentas, especializadas en un cultivo y resistentes a plaguicidas.

Una manera de evitar la pérdida de los cultivos o unos menores rendimientos es la aplicación de fungicidas que evitan o curan una infección por P. infestans. Sin embargo, la aplicación de protectores del cultivo se considera, de modo generalizado, una carga para el medioambiente. Asi, en varios países occidentales, la legislación cada vez es más restrictiva y prohíbe parcialmente la aplicación de fungicidas específicos, haciendo que el control químico de las enfermedades sea más difícil. Una estrategia alternativa es el uso de cultivares que portan una resistencia parcial o completa al tizón tardío. Se han descrito y utilizado dos tipos de resistencia al tizón tardío en el cultivo de la patata. Un tipo de resistencia es conferido por una serie de genes dominantes principales que hacen que el hospedante sea incompatible con razas especificas del patógeno (resistencia especifica de raza). Se han identificado 11 de estos genes R (R1-R11) y se cree que se originaron en la especie de patata salvaje Solanum demissum, que es nativa de México, en donde se encuentra la mayor variación genética del patógeno. Varios de estos genes R han sido cartografiados sobre el mapa genético de la patata (analizado en Gebhardt y Valkonen, 21, Annu. Rev. Phytopathol., 39:79-12). R1 y R2 se localizan sobre los cromosomas 5 y 4, respectivamente. R3, R6 y R7 se localizan sobre el cromosoma 11. También se han descrito genes R desconocidos que confieren resistencia especifica de raza al tizón tardío en S. tuberosum ssp. andigena y S. berthaultii (Ewing et al., 2, Mol. Breeding, 6:25-36). Debido al alto nivel de resistencia y facilidad de transferencia, muchos cultivares contienen la resistencia derivada de S. demissum. Por desgracia, la resistencia especifica de raza derivada de S. demissum, aunque es casi completa, no es perdurable. Cuando cultivares recién reproducidos se cultivan a mayor escala en campos comerciales, emplecan a emerger nuevas virulencias en P. infestans que hacen que el patógeno sea capaz de superar la resistencia ¡ntrogreslonada. Se cree que el segundo tipo de resistencia, denominada resistencia de campo y que, a menudo, tiene naturaleza cuantitativa, no es especifica de raza y es más perdurable. La resistencia de campo al tizón tardío puede encontrarse en varias especies de Solanum mejicanas y de América Central y Sudamérlca (Rossl et al., 1986, PNAS, 95:975-9754).

S. bulbocastanum diploide de México y Guatemala es una de las especies con tubérculos conocidas por sus altos niveles de resistencia de campo al tizón tardío (Niederhauser y Mills, 1953, Phytopathology, 43:456-457). A pesar de las diferencias en los números de balance del endospermo, la introgresión del rasgo de resistencia de S. bulbocastanum ha tenido éxito. Las manipulaciones en la ploidía y una serie de cruzamientos de puentes tediosos han producido un germoplasma resistente a P. infestans derivado de S. bulbocastanum (Hermsen y Ramanna, 1969, Euphytica, 18:27-35; 1973, Euphytica, 22:457-466; Ramanna y Hermsen, 1971, Euphytica, 2:47-481; Hermsen y De Boer, 1971, Euphytica, 2:171-18). Sin embargo, casi 4 años después de los primeros cruzamientos y de esfuerzos de reproducción continuos e intensos por parte de los cultivadores de patata en los Países Bajos con este germoplasma, los cultivares resistentes al tizón tardío aún deben introducirse en el mercado. También se ha indicado la producción satisfactoria de híbridos somáticos de S. bulbocastanum y S. tuberosum (Thieme et al., 1997, Euphytica, 97(2): 189-2; Helgeson et al., 1998, Theor. Appl. Gene!, 96:738-742). Se ha descubierto que algunos de estos híbridos y germoplasmas retrocruzados son muy resistentes al tizón tardío, incluso bajo una presión de enfermedad extrema. A pesar de los informes acerca de la represión de la recombinación, la resistencia en el material retrocruzado parece encontrarse sobre el cromosoma 8 dentro de un intervalo de aproximadamente 6 cM entre los marcadores de RFLP CP53 y CT64 (Naess et al., 2, Theor. Appl. Genet., 11:697-74). Un marcador CAPS derivado de la sonda CT88 de RFLP del tomate se cosegrega con la resistencia. La represión de la recombinación entre los cromosomas de S. bulbocastanum y S. tuberosum representa un obstáculo potencial para la correcta reconstitución del germoplasma de patata cultivada recurrente hasta un nivel que cumpla los estándares de los cultivares de patatas recién reproducidos. El aislamiento de los genes que codifican para la resistencia que se encuentran en S. bulbocastanum y la posterior transformación de los cultivares existentes con estos genes sería una estrategia muchos más rápida y directa cuando se compara con el cruzamiento de introgresión.

La clonación y la caracterización molecular de numerosos genes R vegetales que confieren resistencia a enfermedades de bacterias, hongos, virus, nemátodos e insectos ha identificado varios rasgos estructurales que son característicos de los genes R vegetales (analizado en Dangl y Jones, 21, Nature, 411, 826-833). La mayoría son miembros de familias de multigenes muy relacionadas y todos los genes R caracterizados hasta la fecha, con la excepción de Pto, codifican repeticiones ricas en leucinas (LRR), unas estructuras que se ha demostrado que están implicadas en las interacciones de proteína-proteína. Las LRR contienen genes R que pueden dividirse en dos clases basándose en la presencia de un sitio de unión a nucleótidos tripartito putativo (NBS). Los genes R de la clase NBS-LRR comprenden motivos que son compartidos por proteínas reguladoras de la apoptosis animales (van der Biezen et al., 1998, Curr. Biol., 8, 226-227; Aravind et al., 1999, Trends Biochem. ScL, 24, 47-53) y pueden subdividirse en dos subgrupos basándose en su dominio N-terminal, que muestra similitud de secuencia con la proteína Toll de Drosophila y el dominio del receptor de interleuquina-1 de mamífero (TIR-NBS-LRR), o contiene un dominio helicoidal enrollado o cremallera de leucina potencial (CC-NBS-LRR; Pan et al., 2, Genetics, 155:39- 22). Los genes R de LRR sin un NBS codifican proteínas transmembrana, cuya región N-terminal extracelular está

compuesta por LRR (Jones et al., 1994, Adv. Bot. Res., 24, 89-167). Estos genes pueden dividirse en dos subgrupos basados en la presencia de un dominio de serina/treonina quinasa citosólica (Song et al., 1995, Science, 27, 184- 186). En la actualidad se han clonado cuatro genes R de la patata. Todos ellos, incluyendo el gen R1 derivado de S. demissum que confiere resistencia específica de raza al tizón tardío, pertenecen a la clase CC-NBS-LRR de genes R vegetales (Bendahmane et al., 1999, Plant Cell, 11, 781-791; Bendahmane et al., 2, Plant J., 21, 73-81; van der Vossen et al., 2, Plant Journal, 23, 567-576; Ballvora et al., 22, Plant Journal, 3, 361-371).

La descripción proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura 8, o uno de sus fragmentos funcionales u homólogos. Se ha determinado que la proteína codificada por dicha secuencia de aminoácidos es un miembro de una agrupación de genes identificables mediante un análisis del árbol filogenético, que hasta la fecha consiste en las proteínas Rpi-blb, RGC1- blb, RGC3-blb y RGC4-blb (también denominada en la presente agrupación del gen Rpi-blb) de la figura 9.

El análisis del árbol filogenético se realiza como sigue. En primer lugar, se realiza un alineamiento de múltiples secuencias de las secuencias de los ácidos nucleicos y/o preferiblemente de las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes que se van a analizar empleando CLUSTALW ( http://vvww2.ebi.ac.uk/clustalw ), que se emplea habitualmente en la técnica. ClustalW produce un archivo.dnd, que puede ser leído por TREEVIEW ( http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html ). El árbol filogenético mostrado en la figura 9A es un filograma.

Los estudios filogenéticos de las secuencias de aminoácidos deducidas de Rpi-blb, RGC1-blb, RGC3-blb, RGC4-blb y las de los genes más similares obtenidos en la técnica (según se define con BLASTX) derivados de diversas especies, empleando el método de unión de vecinos de Saitou y Nei (1987, Molecular Biology and Evolution, 4, 46- 425), demuestra que los correspondientes genes, o sus fragmentos funcionales,... [Seguir leyendo]

I.- Un ácido nucleico aislado o recombinante, que comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico según se muestra en la figura 6; o

(¡i) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura 8; o

(i¡¡) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 82% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la figura 8, que comprende un dominio LRR y que es capaz de proporcionar resistencia contra una infección por Phytophthora cuando se incorpora y se expresa en una planta o en una célula vegetal.

2 - El ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico codifica un producto génico que es capaz de proporcionar a un miembro de la familia Solanaceae una resistencia contra un patógeno de Phytophthora.

3 - El ácido nucleico según la reivindicación 2, en el que dicho miembro de la familia Solanaceae es S. tuberosum.

4 - Un vector que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

- Una célula hospedante que comprende un vector según la reivindicación 4, o transformada con el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6 - Una célula hospedante según la reivindicación 5, en la que la secuencia codificadora que proporciona resistencia contra una infección por Phytophthora está bajo el control de un promotor heterólogo.

7.- La célula según la reivindicación 5 o 6 que es una célula vegetal.

8 - La célula según la reivindicación 7, en la que dicha planta es un miembro de la familia Solanaceae.

9 - La célula según la reivindicación 8, en la que la planta es Solanum tuberosum o Lycopersicon esculentum.

1.- Una planta que comprende una célula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.

II.- Una parte derivada de una planta según la reivindicación 1, que comprende una célula hospedante según las reivindicaciones 5 a 9.

12.- La parte según la reivindicación 11, que comprende un tubérculo o un fruto, preferiblemente un tubérculo de patata o un fruto de tomate.

13.- La progenie de una planta según la reivindicación 1, que comprende una célula hospedante según las reivindicaciones 5 a 9.

14.- Una sustancia proteica codificada por un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

15.- El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un vector según la reivindicación 4, o una célula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, o una sustancia según la reivindicación 14, en un método para proporcionar a una planta o a su progenie una resistencia contra una infección por Phytophthora.

16.- El uso según la reivindicación 15, en el que dicha Phytophthora comprende Phytophthora infestans.

17.- El uso según la reivindicación 15 o 16, en el que dicha planta comprende S. tuberosum.

18.- Un método para proporcionar a una planta o a su progenie una resistencia contra una infección por Phytophthora, que comprende proporcionar a dicha planta, o a una de sus partes, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un vector según la reivindicación 4, o una célula según las reivindicaciones 5 a 9, o una sustancia según la reivindicación 14.

19.- Un método para seleccionar una planta o un material vegetal o su progenie para su susceptibilidad o resistencia a una infección por Phytophthora, que comprende ensayar al menos parte de dicha planta o material vegetal o su progenie para detectar la presencia o la ausencia de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.