Silenciamiento génico.

Un constructo, que comprende un casete de expresión que comprende (i) un primer promotor enlazado operativamente a un primer polinucleótido y (ii) un segundo promotor enlazado operativamente a un segundo polinucleótido,

en donde ni el primero ni el segundo polinucleótido se enlaza operativamente a un terminador, en donde dicho constructo produce moléculas de ácido nucleicoque previenen o reducen la expresión de un gen o de un producto génico, y en donde (a) el primer polinucleótido comprende una secuencia de al menos 23 nucleótidos contiguos que comparte identidad de secuencia con un gen objetivo un elemento regulador que se asocia con el gen objetivo, un exón del gen objetivo, un intrón del gen objetivo, una región 5'-no traducida del gen objetivo, y/o la región 3' no-traducida del gen objetivo, (b) el segundo polinucleótido está orientado como una copia de repetición invertida del primer polinucleótido, y (c) el primer promotor y el segundo promotor se orientan para introducir transcripción convergente del primer polinucleótido y el segundo polinucleótido.

Silenciamiento génico Campo de la invención La presente invención se relaciona con constructos únicos para producir un producto de ácido nucleico que regula negativamente o previene la expresión de un polinucleótido objetivo deseado.

Antecedentes de la invención La supresión de la expresión génica se puede lograr por constructos que desencadenan el silenciamiento génico postranscripcional o transcripcional. Estos mecanismos de silenciamiento pueden regular negativamente el polinucleótido deseado o la expresión génica por modificación de la cromatina, escisión de ARN, represión de la traducción, o a través de mecanismos desconocidos hasta la fecha, Ver Meister G. y Tuschl T., Nature, vol. 431, págs. 343-349, 2004.

Un constructo que se usa típicamente en este sentido contiene un polinucleótido deseado, que comparte identidad de secuencia con al menos parte de un gen objetivo que se enlaza operativamente a un promotor y un terminador. Como bien se aprecia, el promotor inicia la transcripción, mientras que el terminador termina la transcripción en un sitio específico y posteriormente media la poliadenilación. Tal procesamiento del transcrito es importante para la estabilidad del transcrito y su transporte a partir del núcleo y en el citoplasma.

En este sentido, el terminador desempeña un papel importante en los constructos de silenciamiento génico convencional. Por ejemplo, WO 99/53050 describe un constructo que comprende un promotor, un polinucleótido que comprende una primera secuencia con homología a un gen objetivo y una segunda secuencia que es complementaria inversa al gen objetivo y un terminador. Un terminador de constructos convencionales no necesariamente se tiene que posicionar inmediatamente corriente abajo del polinucleótido deseado. Por ejemplo, Mette y colaboradores describieron un plásmido que contiene un polinucleótido deseado que se separa de un terminador enlazado operativamente por un gen higromicina (Mette y otros, EMBO J 18:241-8, 1999; Mette y otros, EMBO J 19: 5194-201, 2000) .

Otros constructos convencionales diseñados para silenciar genes contienen un polinucleótido en la orientación sentido o antisentido entre promotor y terminador. Un constructo de silenciamiento génico convencional de ese tipo típicamente produce transcritos de ARN que son similares en tamaño, determinado por la distancia a partir del inicio de la transcripción al sitio de la escisión de la terminación y la cola poli-adenilada.

La presente invención se relaciona con nuevas estrategias y constructos para el silenciamiento génico que son generalmente más eficaces que los constructos convencionales. Además, la presente invención se relaciona con nuevas estrategias y constructos para el silenciamiento génico usando un polinucleótido que no se enlaza operativamente a un promotor y un terminador, pero en su lugar se enlaza operativamente a dos promotores convergentemente orientados.

Breve descripción de la invención Las estrategias y constructos se pueden caracterizar por ciertas características. Un constructo, por ejemplo, puede no comprender una región de ADN, tal como un terminador, que se implica en la formación del extremo 3' y poliadenilación. Alternativamente, el constructo puede comprender un terminador no funcional que es naturalmente no funcional o que se ha modificado o mutado para volverse no funcional.

Un constructo se puede caracterizar además en el arreglo de los promotores en ambos lados de un polinucleótido deseado. De ahí que, un constructo puede comprender dos o más promotores que flanquean uno o más polinucleótidos deseados o que flanquean copias de un polinucleótido deseado, tal que se transcriben ambas cadenas del polinucleótido deseado. Es decir, un promotor se puede orientar para iniciar la transcripción del extremo 5' de un polinucleótido deseado, mientras que un segundo promotor se puede orientar operativamente para iniciar la transcripción a partir del extremo 3' del mismo polinucleótido deseado. Los promotores orientados de forma opuesta pueden flanquear múltiples copias del polinucleótido deseado. De ahí que, el "número de copia" puede variar de manera que un constructo puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100, o más de 100 copias, o cualquier número entero entre estos, de un polinucleótido deseado en última instancia flanqueado por promotores que se orientan para inducir la transcripción convergente.

Alternativamente, un primer promotor se puede enlazar operativamente a un primer polinucleótido en el "casete A, " por ejemplo, y un segundo promotor se puede enlazar operativamente a un segundo polinucleótido, por ejemplo, "casete B." Los polinucleótidos de cada casete pueden o no pueden comprender la misma secuencia de nucleótidos, pero pueden compartir algún porcentaje de identidad de secuencia con un ácido nucleico objetivo de interés. Los casetes se pueden arreglar en forma de tandem, es decir, de manera que son adyacentes uno al otro en el constructo. Además, el casete B, por ejemplo, se puede orientar en la orientación complementaria inversa al casete A. En este arreglo, por lo tanto, la transcripción a partir del promotor del casete B procederá en la dirección hacia el promotor del casete A. De ahí que, los casetes se arreglan para inducir la "transcripción convergente."

Si ninguno de los dos casetes comprende una secuencia de terminador, después un constructo de ese tipo, en virtud del arreglo de transcripción convergente, puede producir transcritos de ARN que son de diferentes longitudes.

En esta situación, por lo tanto, pueden existir subpoblaciones de transcritos de ARN parcialmente o completamente transcritos que comprenden secuencias parciales o completas del polinucleótido transcrito deseado del casete respectivo. Alternativamente, en ausencia de un terminador funcional, la maquinaria de transcripción puede proceder más allá del final de un polinucleótido deseado para producir un transcrito que es más largo que la longitud del polinucleótido deseado.

En un constructo que comprende dos copias de un polinucleótido deseado, por lo tanto, donde uno de los polinucleótidos se puede o no puede orientar en la dirección complementaria inversa a la otra, y donde los polinucleótidos se enlazan operativamente a promotores para inducir la transcripción convergente, y no existe terminador funcional en el constructo, la maquinaria de transcripción que se inicia a partir de un polinucleótido deseado puede proceder hasta transcribir la otra copia del polinucleótido deseado y viceversa. Las copias múltiples del polinucleótido deseado se pueden orientar en varias permutaciones: en el caso donde dos copias del polinucleótido deseado están presentes en el constructo, las copias se pueden, por ejemplo, orientar por ejemplo tanto en la misma dirección, en la orientación inversa una a la otra, como en la orientación de complemento inverso una a la otra.

En un arreglo donde uno de los polinucleótidos deseados se orienta en la orientación complementaria inversa al otro polinucleótido, se puede producir un transcrito de ARN que comprende no sólo la secuencia "sentido" del primer polinucleótido, sino además la secuencia "antisentido" a partir del segundo polinucleótido. Si el primer y segundo polinucleótidos comprenden la misma o sustancialmente las mismas secuencias de ADN, el único transcrito de ARN puede comprender después dos regiones que son complementarias una a la otra y que pueden, por tanto, aparear. De ahí que, el único transcrito de ARN que así se transcribe, puede formar una estructura bicatenaria de horquilla parcial o completa.

Por otro lado, si se produjeron dos copias de un transcrito largo de ese tipo, uno a partir de cada promotor, existirán después dos moléculas de ARN, cada una de las cuales puede compartir regiones de complementariedad de secuencia con la otra. De ahí que, la región "sentido" del primer transcrito de ARN puede aparear con la región "antisentido" del segundo transcrito de ARN y viceversa. En este arreglo, por lo tanto, otro ARN bicatenario se puede formar que consistirá de dos transcritos de ARN separados, a diferencia de una horquilla bicatenaria que se forma a partir de un único transcrito de ARN autocomplementario.

Alternativamente, dos copias del polinucleótido deseado se pueden orientar en la misma dirección de manera que, en el caso de lectura completa de la transcripción, el transcrito de ARN largo que se produce a partir de un promotor puede comprender, por ejemplo, la secuencia sentido de la primera copia del polinucleótido deseado y además la secuencia sentido de la segunda copia del polinucleótido deseado. El transcrito de ARN que se produce a partir del otro promotor... [Seguir leyendo]

1. Un constructo, que comprende un casete de expresión que comprende (i) un primer promotor enlazado operativamente a un primer polinucleótido y (ii) un segundo promotor enlazado operativamente a un segundo polinucleótido, en donde ni el primero ni el segundo polinucleótido se enlaza operativamente a un terminador, en donde dicho constructo produce moléculas de ácido nucleicoque previenen o reducen la expresión de un gen o de un producto génico, y en donde (a) el primer polinucleótido comprende una secuencia de al menos 23 nucleótidos contiguos que comparte identidad de secuencia con un gen objetivo un elemento regulador que se asocia con el gen objetivo, un exón del gen objetivo, un intrón del gen objetivo, una regió.

5. no traducida del gen objetivo, y/o la región 3' no-traducida del gen objetivo, (b) el segundo polinucleótido está orientado como una copia de repetición invertida del primer polinucleótido, y (c) el primer promotor y el segundo promotor se orientan para introducir transcripción convergente del primer polinucleótido y el segundo polinucleótido.

2. El constructo de la reivindicación 1, en donde ni el primero ni el segundo polinucleótido se enlaza operativamente a

(i) un gen terminador nos, (ii) la secuencia 3' no-traducida del gen T-ADN 7, (iii) la secuencia 3' no-traducida del principal gen de inclusión de la proteína corporal del virus del mosaico de la coliflor, (iv) las secuencias 3' notraducidas de la subunidad menor de la ribulosa 1, 5-bisfosfato carboxilasa de chícharo, (v) las secuencias 3' notraducidas del gen ubiquitina-3 de la papa, o (vi) las secuencias 3' no-traducidas del gen inhibidor de proteinasa II de la papa, (vii) las secuencias 3' no-traducidas de los genes de opina (viii) las secuencias 3' no-traducidas de genes endógenos.

3. El constructo de la reivindicación 1, en donde el gen objetivo es un gen COMT implicado en la biosíntesis de lignina, un gen CCOMT implicado en la biosíntesis de lignina, cualquier otro gen implicado en la biosíntesis de lignina, un gen R1 implicado en la fosforilación del almidón, un gen fosforilasa implicado en la fosforilación del almidón, un gen PPO implicado en la oxidación de los polifenoles, un gen poligalacturonasa implicado en la degradación de la pectina, un gen implicado en la producción de alergénos, un gen implicado en la biosíntesis de ácido graso tal como FAD2.

4. El constructo de la reivindicación 1, en donde el primer y segundo promotores son funcionales en una planta y en donde el casete de expresión se ubica entre secuencias bordes del ADN de transferencia de un plásmido que es adecuado para la transformación de la planta mediada por bacteria, en donde la bacteria es una cepa de Agrobacterium, Rhizobium, o Phyllobacterium.

5. El constructo de la reivindicación 1, que además comprende un polinucleótido separador posicionado entre el primer y segundo polinucleótidos, en donde el polinucleótido separador es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, o más de 500 nucleótidos de largo.

6. El constructo de la reivindicación 1, en donde el primer promotor es un promotor constitutivo, un promotor constitutivo cercano, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible y en donde el segundo promotor es un promotor constitutivo, un promotor constitutivo cercano, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible.

7. Un plásmido de transformación que comprende el constructo de la reivindicación 1, en donde el plásmido de transformación comprende un casete de expresión, que comprende en la orientación 5' a 3' (1) un primer promotor que se enlaza operativamente a (2) un primer polinuceótido deseado, que limita con (3) al menos un polinucleótido separador opcional, donde el extremo 3' de uno de los polinucleótidos separadors limita con (4) un segundo polinucleótido deseado, que se enlaza operativamente a (5) un segundo promotor, en donde ningún polinucleótido deseado en el casete de expresión se enlaza operativamente a cualquier terminador de la transcripción, en donde dicho constructo produce moléculas de ácido nucleico que previenen o reducen la expresión de un gen o de un producto génico, y en donde el segundo polinucleótido deseado está orientado como un complemento inverso del primer polinucleótido deseado.

8. El plásmido de transformación de la reivindicación 7, en donde (a) al menos parte del primer polinucleótido deseado está en la orientación antisentido; o (b) al menos parte del primer polinucleótido deseado está en la orientación

sentido; o (c) al menos parte del primer polinucleótido deseado de (a) o (b) es una secuencia del promotor o comparte identidad de secuencia con una secuencia del promotor.

9. El plásmido de transformación de la reivindicación 8, en donde la secuencia de (c) comparte identidad de secuencia con un promotor que se asocia con un gen endógeno y se selecciona del grupo consistente de (1) un promotor del gen R1 asociado al almidón, (2) un promotor del gen polifenol oxidasa, (3) un promotor del gen ácido graso desaturasa 12, (4) un promotor del gen microsomal ácido graso omega-6 desaturasa, (5) un promotor del gen delta 9 portador de estearoilacil-desaturasa de algodón, (6) un promotor del gen oleoilfosfatidilcolina omega 6desaturasa, (7) un promotor del gen ácido cafeico/ácido 5-hidroxiferulico 3/5-0-metiltransferasa (COMT) de Medicago truncatula, (8) un promotor del gen ácido cafeico/ácido 5-hidroxiferulico 3/5-O-metiltransferasa (COMT) de Medicago sativa (alfalfa) , (9) un promotor del gen cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa (CCOMT) de Medicago truncatula, (10) un promotor del gen cafeoil CoA 3-0-metiltransferasa (CCOMT) de Medicago sativa (alfalfa) , (11) un gen COMT de Zea mays (maíz) , (12) un promotor del gen del alérgeno principal de manzana Mal d I, (13) un promotor del gen del alérgeno principal del cacahuete Ara h 2, (14) un promotor del gen del alérgeno principal del frijol de soja Gly m Bd 30 K, (15) un promotor del gen poligalacturonasa, (16) cualquier otro promotor endógeno.

10. El plásmido de transformación de la reivindicación 9, en donde (1) (i) al menos uno del primer y segundo promotores es un promotor GBBS y (ii) el primer polinucleótido deseado es una secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos una parte de un promotor asociado con un gen polifenol oxidasa; (2) tanto el primero como el segundo promotores son promotores GBSS; o (3) el primer promotor es un promotor GBBS y el segundo promotor es un promotor AGP.

11. Un método para reducir la expresión de un gen normalmente capaz de expresarse en una célula de planta, que comprende exponer una célula de planta al constructo de la reivindicación 1, en donde el constructo se mantiene en una cepa bacteriana, seleccionada del grupo consistente de Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium trifolii, Rhizobium leguminosarum, Phyllobacterium myrsinacearum, SinoRhizobium meliloti, y MesoRhizobium loti, en donde el polinucleótido deseado comprende una secuencia que comparte identidad de secuencia con una secuencia objetivo en el genoma celular de la planta.

12. El constructo de la reivindicación 1, que comprende un casete de expresión que comprende en la orientación de 5' a 3' (i) un primer promotor, (ii) un primer polinucleótido que comprende una secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos una parte de una secuencia de promotor asociada con un gen objetivo, (iii) un segundo polinucleótido que comprende una secuencia que comparte identidad de secuencia con el complemento inverso de al menos parte del promotor asociado con el gen objetivo, y (iv) un segundo promotor, en donde el primer promotor se enlaza operativamente al extremo 5' del primer polinucleótido y el segundo promotor se enlaza operativamente al extremo 3' del segundo polinucleótido, en donde dicho constructo produce moléculas de ácido nucleico que previenen o reducen la expresión de un gen o de un producto génico, y en donde ni el primero ni el segundo polinucleótido se enlaza operativamente a un terminador, y en donde el segundo polinucleótido está orientado como un complemento inverso del primer polinucleótido.

13. Un plásmido de transformación de planta que comprende el constructo de la reivindicación 1, en donde el plásmido de transformación de planta, comprende la secuencia descrita en la sec. con núm. de ident.: 40 o 42.

14. Un método para reducir el endulzamiento inducido por frío en un tubérculo, que comprende expresar el constructo de la reivindicación 1 en una célula de un tubérculo, en donde (a) el primer polinucleótido comprende la secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos una parte de un gen R1 o con al menos una parte de un promotor del gen R1, (c) uno o ambos de los primero y segundo promotores son GBSS o AGP, y (d) expresión del constructo en la célula reduce la transcripción y/o traducción de un gen R1 en un genoma celular de tubérculo, reduciendo así el endulzamiento inducido por frío en el tubérculo.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el primer polinucleótido comprende la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 23 o 24.

16. Un método para mejorar la tolerancia a la mancha negra por magullamiento en un tubérculo, que comprende expresar el constructo de la reivindicación 1 en una célula de un tubérculo, en donde (a) el primer polinucleótido comprende la secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos parte de un gen polifenol oxidase expresado en un tubérculo un promotor de un gen polifenol oxidase expresado en un tubérculo, (c) uno o ambos de

los primero y segundo promotores son GBSS o AOP, y (d) y expresión del constructo en la célula reduce la transcripción y/o traducción de un gen polifenol oxidase en un genoma celular de tubérculo, mejorando así la tolerancia del tubérculo a la mancha negra por magullamiento.

17. El método de la reivindicación 16, en donde el primer polinucleótido comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 26 o 27.

18. Un método para aumentar los niveles de ácido oleico en una planta que porta aceite, que comprende expresar el constructo de la reivindicación 1 en una célula de una semilla de una planta que porta aceite, en donde (a) el primer polinucleótido comprende una secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos una parte de un gen Fad2 o un promotor del gen Fad2, (c) uno o ambos de los primero y segundo promotores son gen nabo, el gen Fad2, o promotores del gen estearoil-ACP desaturasa, y (d) expresión del constructo en la célula reduce la transcripción y/o traducción de un gen Fad2 en la célula de la semilla de la planta que porta aceite, aumentando así el contenido de aceite de la semilla.

19. El método de la reivindicación 18, en donde (i) el primer polinucleótido comprende la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 28 o una secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos una parte de la sec. con núm. de ident.: 28; o (ii) la secuencia la secuencia del promotor del gen nabo comprende la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 30; o (iii) la secuencia del promotor del gen estearoil-ACP desaturasa comprende la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 31; o (iv) la secuencia del promotor del gen Fad2 comprende la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 32, o permutaciones de (i) - (iv) existentes en el constructo.

20. El método de la reivindicación 19, en donde la planta portadora de aceite es una planta Brassica, planta de canola, planta de frijol de soja, planta de algodón, o una planta de girasol.

21. Un método para reducir el contenido de lignina en una planta, que comprende expresar el constructo de la reivindicación 1 en una célula de la planta, en donde (a) el primer polinucleótido comprende una secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos parte de la secuencia del promotor asociada a un gen seleccionado del grupo consistente del gen de ácido cafeico/ácido 5-hidroxiferulico 3/5-0-metiltransferasa (COMT) y gen cafeoil CoA 3-0-metiltransferasa (CCOMT) , (c) uno o ambos de los primero y segundo promotores son promotores de genes petE o Pal, y (d) expresión del constructo en la célula reduce la transcripción y/o traducción de un gen COMT o CCQMT en la célula de la planta, reduciendo así el contenido de lignina en una planta.

22. El método de la reivindicación 21, en donde la planta es una planta de alfalfa y en donde el primer polinucleótido comprende al menos una parte de la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 33 o 37.

23. Un método para reducir la degradación de la pectina en un fruto de una planta, que comprende expresar el constructo de la reivindicación 1 en una célula fruto de la planta, en donde (a) el primer polinucleótido comprende la secuencia de una parte del gen de la poligalacturonasa, (c) ambos de los primero y segundo promotores son promotores específicos de la fruta, y (d) expresión del constructo en la célula de fruta reduce la transcripción y/o traducción de un gen de la poligalacturonasa en la célula de la planta, reduciendo así la degradación de la pectina en el fruto.

24. El método de la reivindicación 23, en donde el primer polinucleótido comprende la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 39 o al menos una parte de la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 39.

25. Un método para reducir la alergenicidad de un alimento producido por una planta, que comprende expresar el constructo de la reivindicación 1 en una célula de una planta, en donde (a) el primer polinucleótido comprende la secuencia de una parte de un gen que codifica un alérgeno, y (c) la expresión del constructo reduce la transcripción y/o traducción del alergeno, reduciendo así la alergenicidad de un alimento producido por la planta.

26. El método de la reivindicación 25, en donde (1) (a) la planta es una planta de manzana, (b) la comida es una manzana, (c) el primer polinucleótido comprende una secuencia del promotor del gen Mal d l, y (d) la expresión del constructo en una planta de manzana reduce la transcripción y/o traducción de Mal d I en la manzana; o (2) (a) la planta es una planta de cacahuete, (b) la comida es un cacahuete, (c) el primer polinucleótido comprende una secuencia del promotor del gen de Ara h 2, y (d) la expresión del constructo en el planta de cacahuete reduce la

transcripción y/o traducción de Ara h 2 en el cacahuete; o (3) (a) la planta es una planta de frijol de soja, (b) la comida es un frijol de soja, (c) el primer polinucleótido comprende una secuencia del promotor del gen Gly m Bd, y

(d) la expresión del constructo en el planta de frijo de soja reduce la transcripción y/o traducción de Gly m Bd en el frijol de soja.

27. Un método para la regulación negativa de la expresión de múltiples genes en una planta, que comprende expresar en una célula de una planta (1) un constructo que comprende la secuencia que comparte identidad de secuencia con al menos parte de la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 40, que regula negativamente la expresión del gen de la polifenol oxidasa, fosforilasa L, y el gen R1 en la célula vegetal; o (2) un constructo que comprende la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 42, que regula negativamente la expresión del gen de la polifenol oxidasa, gen fosforilasa L, y gen R1 en la célula vegetal.

28. El método de la reivindicación 19, en el que el primer polinucleótido comprende una secuencia con homología a (i) al menos parte de la secuencia representada en la sec. con núm. de ident.: 28; o (ii) al menos parte de la secuencia del promotor asociado con el gen nabo que se representa en la sec. con núm. de ident.: 30; o (iii) al menos parte de la secuencia del promotor del gen estearoil-ACP desaturasa se representa en la sec. con núm. de ident.: 31; o (iv) al menos parte de la secuencia del promotor del gen Fac2 representada en la sec. con núm. de ident.: 32, o permuataciones de (i) - (iv) existentes en el constructo.