SECUENCIA DE ADN MÍNIMA QUE ACTÚA COMO UN AISLANTE DE CROMATINA, Y SU USO EN LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS.

Uso de un vector que comprende uno o más aislantes de la cromatina que consisten en la SEQ ID NO:

1 para la expresión de un gen de interés en una célula CHO

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN de 146 pb capaz de actuar como aislante de la cromatina, a células huésped CHO que contienen tales vectores y a un método de producción de un polipéptido deseado en células CHO usando vectores que 5 contienen dicha secuencia.

Antecedentes de la invención

La introducción de genes en células de mamíferos por transfección conduce a su integración estable en el genoma de las células huésped. Normalmente, este evento de integración es raro (<0,01%) y ocurre de una manera aleatoria con respecto al locus de integración. La expresión del transgén 10 integrado depende del entorno local. Esto significa que potenciadores o silenciadores cercanos pueden afectar a la expresión, y los genes pueden llegar a ser inactivados por extensión de heterocromatina (efecto de la posición de la cromatina, CPE por sus siglas en inglés, también llamado silenciamiento).

Durante los últimos años, estudios que empezaron en Drosophila y ahora se extienden a vertebrados, han identificado elementos de secuencias de ADN llamados aislantes que parecen funcionar 15 como "barrera", impidiendo el CPE, y/o como "bloqueante de potenciadores", teniendo la capacidad de proteger a un promotor frente a la acción de un potenciador distal sin impedir que el potenciador funcione sobre un promotor proximal. Por tanto, los aislantes son elementos de secuencias de ADN que protegen regiones transcritas de secuencias regulatorias no relacionadas distantes.

Las primeras secuencias de ADN descritas por tener las propiedades de un aislante fueron 20 elementos scs (estructuras de cromosoma especializadas) de Drosophila. Chung y Felsenfeld describieron un elemento, 5'HS4 (Sitio Hipersensible a Dnasa I), que actúa como aislante contenido dentro de un fragmento de ADN de 1,2 kb derivado del extremo 5' del locus de la B-globina de pollo (Chung et al., 1993, patente de EE.UU. 5610053). Se demostró que gran parte de la actividad del aislante estaba contenida en un fragmento de 250 pb, la región "central", que está incluido en la secuencia del 25 5'HS4 (Chung et al., 1997). El ADN de la región central se diseccionó adicionalmente en cinco regiones marcadas con huella (FI-FV) y se demostró que era rico en GC con las propiedades de una "isla CpG", pero no pareció funcionar como un promotor. Los experimentos demostraron que sólo era necesaria una región, FII, para la propiedad de bloqueo del potenciador, y la purificación de sus proteínas de unión reveló que la unión de CTCF (factor de unión a CCCTC) era la responsable de su actividad (Bell et al., 30 1999).

En otro estudio, la utilidad del elemento aislante de beta globina de 1,2 kb completo en la protección de mensajeros frente al CPE ha sido demostrada en ensayos in vivo que incluyeron ratones transgénicos (Ciana et al., 2001). En líneas celulares CHO, Izumi y Gilbert demostraron que la presencia de secuencias aislantes de la cromatina mejoró moderadamente la estabilidad pero no fue suficiente para 35 producir transformantes homogéneos (Izumi y Gilbert, 1999).

En una publicación reciente (Recillas-Targa et al., 2002) se revisó la actividad funcional de un elemento aislante de 1,2 kb del gen de la beta-globina de pollo. Además de funcionar como una barrera eficaz frente a la actividad de potenciadores o silenciadores cercanos, se demostró que el elemento central de 250 pb era suficiente para conferir protección contra el silenciamiento de genes causado por el 40 CPE y proporcionar una expresión estable a largo plazo. Dos copias de fragmentos más pequeños de la secuencia central de 250 pb desprovistas esencialmente de la región huella II, en cada lado del gen mensajero, fueron suficientes para conferir protección frente al CPE, pero no bloqueo de potenciadores, en células 6C2 pre-eritroides de pollo.

Dado que los tamaños de los vectores preferiblemente no deben exceder de 10 kb, hay una 45 necesidad de reducir el tamaño de los elementos regulatorios presentes en estos vectores. Por ejemplo, la estabilidad de los vectores aumenta según se reduce el tamaño de su ADN. Vectores más pequeños pueden albergar segmentos más grandes de insertos. Además, los elementos pequeños simplifican la modificación de los vectores de expresión y permiten construcciones donde la longitud total del inserto debe ser limitada. 50

Es por tanto un objeto de esta invención proporcionar el uso de un elemento de ADN corto que tiene actividad aislante cuando se usa en vectores para la expresión de un gen de interés en células CHO.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que un elemento de ADN corto de 146 pb, que tiene la secuencia de SEQ ID No: 1, es capaz de actuar como aislante de la cromatina. En lo que 55 sigue, el aislante se llama "el aislante". El número de clones transfectados que expresaron el gen de interés se elevó cuando los constructos usados incluyeron el aislante. Se demostró que la producción del polipéptido de interés era más alta en clones expresantes que contenían el aislante de la invención y se demostró que la expresión a largo plazo era estable.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de un vector que comprende uno o más aislantes de la cromatina que consisten en la SEQ ID NO:1 para la expresión de un gen de interés en una célula CHO.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a una célula huésped CHO que comprende un vector acorde con la invención. 5

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de transfectar una célula huésped CHO con un vector acorde con la invención.

Se describe el uso de un vector de la invención para la fabricación de un medicamento para uso en terapia basada en plásmidos o ADN o terapia génica. 10

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 muestra un alineamiento del aislante de la SEQ ID NO:1 (A) con la región aislante central de 250 pb de la técnica anterior (B) de la región aislante 5'HS4 de la beta-globina de pollo.

Fig. 2 muestra dos constructos mensajeros bidireccionales para la expresión de IL18BP. A: El gen IL18BP se muestra como una línea en negrita y los promotores mCMV-IE1 y mCMV-IE2 se indican como flechas. 15 El triángulo representa el intrón A de la región IE de hCMV y el óvalo representa la señal de poliadenilación. El aislante (círculo relleno), designado como INS, flanquea como repetición en tándem cada extremo de la caja de expresión. B: mismo constructo desprovisto de secuencias aislantes.

Fig. 3 muestra la unidad de expresión para la Luciferasa. A: El gen de la luciferasa se muestra como una línea en negrita y el promotor CMV humano (hCMVp) está indicado como una flecha. La forma oval 20 representa la señal de poliadenilación. El aislante (círculo relleno), designado como INS, flanquea como repetición en tándem cada extremo de la caja de expresión. B: mismo constructo desprovisto de secuencias aislantes.

Fig. 4 muestra la expresión de luciferasa medida como ULR (unidades de luz relativas) en grupos estables de células CHO-S transfectadas en SFM a los 3 meses después de la transfección con constructos 25 aislados con aislante (l.hCMV Luc.l, Fig. 3A) o no aislados (hCMV Luc, Fig. 3B) en presencia o ausencia de puromicina (puro). 96 clones individuales escogidos al azar para cada una de las cuatro condiciones fueron clasificados y representados gráficamente por niveles crecientes de expresión de luciferasa (cada incremento en el eje X representa un clon).

Fig. 5 muestra la expresión de luciferasa medida como ULR (unidades de luz relativas) en células CHO-S 30 transfectadas de manera transiente con los constructos plns(2)-SV-Luc, plns(2)revSV-Luc, pSV-Luc, pGL3-ctrl, o transfectadas como control ("mock").

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que un elemento de ADN corto de 146 pb, que tiene la secuencia de SEQ ID No: 1, es capaz de actuar eficazmente como aislante de la 35 cromatina cuando se duplica e inserta corriente arriba y corriente abajo de una unidad de expresión. La presencia del aislante en vectores de transfección aumentó significativamente el número de clones que expresaban un gen marcador. Además, los grupos...

1. Uso de un vector que comprende uno o más aislantes de la cromatina que consisten en la SEQ ID NO: 1 para la expresión de un gen de interés en una célula CHO.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho vector comprende además al menos un elemento de ADN seleccionado de: 5

a. un potenciador, o un fragmento potenciador de la expresión funcional del mismo;

b. un dominio promotor o un fragmento promotor de la expresión funcional del mismo; y

c. una secuencia de ADN que codifica uno o más polipéptidos de interés.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho vector comprende además una o más secuencias de ADN que codifican elementos regulatorios seleccionados entre 5'UTRs, intrones, 3'UTRs, secuencias 10 procesadoras del extremo 3' de ARNm, sitios de poliadenilación y secuencias de entrada interna al ribosoma (IRES).

4. El uso según la reivindicación 2 ó 3, en el que la secuencia de ADN codifica más que un polipéptido de interés mediante un ARNm policistrónico.

5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector comprende además uno o 15 más elementos de ADN seleccionados entre elementos frontera, regiones de control del locus (LCRs), regiones de unión a la matriz (MARs), y elementos para la recombinación e intercambio de cajas.

6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor se selecciona entre promotores celulares o virales/fagos tales como mCMV-IE1, mCMV-IE2, hCMV, SV40, RSV, T7, T3, o un fragmento promotor de la expresión funcional de los mismos. 20

7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de interés se selecciona entre FSH, LH, CG, TSH, hormona del crecimiento, interferón, proteína de unión al TNF I, proteína de unión al TNF II, IL-18BP, IL-6, IFNAR1, LIF o muteínas, fragmentos, derivados funcionales, proteínas de fusión de los mismos.

8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de interés se selecciona 25 entre EPO, G-CSF, GM-CSF, una cadena de un anticuerpo humanizado, una citocina, un factor de coagulación, etanercept, tPA, una integrina o muteínas, fragmentos, derivados funcionales, proteínas de fusión de los mismos.

9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de interés se selecciona entre adenosina desaminasa (ADA), aminoglicósido fosfotransferasa (neo), dihidrofolato reductasa 30 (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina quinasa (tk), xantina-guanina fosforribosiltransferasa (gpt), gen de resistencia múltiple a los fármacos (MDR), ornitina descarboxilasa (ODC) y gen de resistencia al N-(fosfonacetil)-L-aspartato (CAD), puromicina actiltransferasa (PAC), galactoquinasa, receptor de folato humano, o portadores de folato reducido.

10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de interés se selecciona 35 entre luciferasa, proteína fluorescente verde, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante o combinaciones de las mismas.

11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que un aislante está posicionado corriente arriba y un aislante está posicionado corriente abajo de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés. 40

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que al menos dos aislantes están posicionados corriente arriba y corriente abajo de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, respectivamente.

13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que al menos dos secuencias codificantes están posicionadas entre los aislantes. 45

14. El uso según la reivindicación 13, en el que las al menos dos secuencias codificantes codifican subunidades de una proteína multimérica.

15. El uso según la reivindicación 14, en el que la primera subunidad es la cadena alfa y la segunda subunidad es la cadena beta de una hormona seleccionada entre FSH humana, LH humana, TSH humana y CG humana. 50

16. El uso según la reivindicación 14, en el que la primera subunidad es la cadena beta y la segunda subunidad es la cadena alfa de una hormona seleccionada entre FSH humana, LH humana, TSH humana y CG humana.

17. El uso según la reivindicación 14, en el que la primera subunidad es la cadena pesada y la segunda subunidad es la cadena ligera de una inmunoglobulina. 55

18. El uso según la reivindicación 14, en el que la primera subunidad es la cadena ligera y la segunda subunidad es la cadena pesada de una inmunoglobulina.

19. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la expresión simultánea de dos o más genes o ADNs de interés.

20. Una célula CHO transfectada con un vector como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 19.

21. Un procedimiento para la producción de un polipéptido de interés, que comprende la etapa de transfectar una célula CHO con al menos un vector como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

22. Un procedimiento para la producción de un polipéptido de interés, que comprende la etapa de cultivar 10 una célula CHO acorde con la reivindicación 20.

23. El procedimiento según la reivindicación 21 ó 22, que comprende además la etapa de aislar el polipéptido de interés de las células CHO.

24. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que la transfección es transfección estable. 15