RECEPTORES DE FC SOLUBLES RECOMBINANTES.

Preparación cristalina de un receptor de Fcγ o Fcε

soluble recombinante, caracterizándose dicho receptor por la ausencia de dominios transmembránicos, péptido señal y glucosilación, y obteniéndose mediante expresión de un ácido nucleico que codifica tal receptor en procariotas.

La presente invención se refiere a preparaciones cristalinas de un receptor de Fc o Fc soluble recombinante, un complejo de receptor de Fc o Fc soluble recombinante/inmunoglobulina, y especialmente al uso de tal preparación cristalina para la generación de datos de la estructura cristalina de receptores de Fc, así como a inhibidores de FcR.

También se describen receptores de Fc solubles recombinantes (FcR), ácidos nucleicos recombinantes que codifican tales receptores de Fc, células hospedantes que contienen los ácidos nucleicos correspondientes, así como un procedimiento para la determinación de la cantidad de anticuerpos de un cierto tipo contenidos en la sangre, plasma o suero de un paciente, un procedimiento para la determinación del estado inmunológico de pacientes con enfermedades crónicas del sistema inmunitario, y un procedimiento para la identificación de sustancias en vista de su capacidad para actuar como inhibidores del reconocimiento y unión de anticuerpos a los receptores celulares respectivos. Además, se describen composiciones farmacéuticas que contienen los FcR solubles recombinantes, y composiciones farmacéuticas que contienen los inhibidores de FcR.

También se describe un receptor de Fc recombinante acoplado a una fase sólida, por ejemplo un material soporte de cromatografía. El uso de tal material de cromatografía se basa en la absorción de inmunoglobulinas procedentes de un fluido corporal de pacientes, o de sobrenadantes de cultivo de células productoras de inmunoglobulinas.

Los receptores de Fc (FcR) desempeñan un papel fundamental en la defensa del organismo humano contra las infecciones. Después de que los patógenos han logrado acceso a la circulación sanguínea, son opsonizados por las inmunoglobulinas (Ig). Debido a su multivalencia, los inmunocomplejos resultantes se unen con gran avidez a las células portadoras de FcR, conduciendo al agrupamiento de los FcR, lo que desencadena varias funciones efectoras (Metzger, H., 1992A). Estas incluyen, dependiendo del tipo de FcR expresado y de las proteínas asociadas, endocitosis con neutralización subsiguiente de los patógenos y presentación de antígenos, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), secreción de mediadores, o la regulación de la producción de anticuerpos (Fridman et al, 1992; van de Winkel y Capel, 1993).

Existen FcR específicos para todas las clases de Ig, siendo aquellos para IgG los más abundantes con la más amplia diversidad. Junto con el receptor de alta afinidad para IgE (FcRIa), FcRI (CD64), FcRII (CD32) y FcRIIIa (CD16), aparecen como proteínas transmembránicas de tipo I, o en formas solubles (sFcR), pero existe también una forma del FcRIII anclada a glucosilfosfatidilinositol (FcRIIIb). Además, los FcR existen en diversas isoformas (FcRIa, b1, b2, c; FcRIIa 1–2, b1–3, c) y alelos (FcRIIa1–HR, –LR; FcRIIIb–NA1, –NA2) (van de Winkel y Capel, 1993). En contraste con las partes extracelulares homólogas globales, los dominios que se extienden sobre la membrana y los dominios citoplásmicos difieren. Pueden estar totalmente suprimidos, o tener un tamaño de 8 kDa. Pueden contener un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) de 26 aminoácidos, como en FcRIIa, o un motivo inhibidor (ITIM) respectivo de 13 aminoácidos en FcRIIb, implicado en transducción de señales (Amigorena et al, 1992).

A juzgar por la separación conservada de cisteínas, la parte extracelular de los FcR consiste en tres (FcRI, CD64) o dos (FcRI, FcRII, CD32 y FcRIII, CD16) dominios similares a Ig (10 kDa/dominio), y por lo tanto pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Estos receptores altamente glucosilados son homólogos, y la identidad global en la secuencia de aminoácidos entre los FcR yFcRIa excede el 50% en sus regiones extracelulares. No obstante, la afinidad de los FcR a sus ligandos varía ampliamente. La mayor afinidad de ≈ 108M–1 del FcRI al fragmento Fc se asigna a su tercer dominio, mientras que los otros FcR con dos dominios tienen una afinidad por IgG que varía entre 105 y 107M–1. La afinidad del FcRIa de dos dominios por IgE supera de lejos estos valores, con una constante de 1010M–1 (Metzger, H., 1992B). En contraste con los FcR mencionados, el receptor de baja afinidad para IgE, FcRII, representa una proteína transmembránica de tipo II, y muestra una menor homología.

Hasta ahora, los FcR usados para la cristalización han sido expresados en células hospedantes eucariotas. Gastinel et al. (1992) describen la expresión heteróloga de receptores de Fc de las células epiteliales intestinales del neonato (FcRn) en una estirpe celular eucariota, y una preparación cristalina para esos receptores de Fc.

Los FcR se expresan en un patrón definido en todas las células inmunológicas activas. FcRI se expresa constitutivamente en monocitos y macrófagos, y puede ser inducido en neutrófilos y eosinófilos. El papel fisiológico de FcRI se desconoce todavía, dado que la expresión en monocitos no es vital (Ceuppens et al, 1988). La forma de FcRIII anclada a GPI (FcRIIIb) se expresa exclusivamente en granulocitos. Debido a su parte citoplásmica ausente, la transducción de señales en la célula ocurre solamente por la vía de otras proteínas transmembránicas, como el receptor del complemento tipo 3 (CR3), que puede asociarse al menos con FcRIIIb (Zhou et al, 1993; Poo et al, 1996). FcRIIIa se expresa principalmente en monocitos y macrófagos, pero sólo en conjunción con proteínas asociadas (v.g., cadenas  o ). FcRII es el receptor con la distribución más amplia en células inmunocompetentes, y está implicado principalmente en la endocitosis de los inmunocomplejos.

**(Ver fórmula)**

FcRIIa y FcRIIb difieren en su región extracelular en sólo un 7% de los restos de aminoácidos. No obstante, ambas formas se pueden distinguir por sus características de unión a las subclases IgG humanas y de ratón (van de Winkel y Capel, 1993) y su diferente afinidad por las IgG humanas (Sondermann et al, 1998A). La situación se hace más complicada aún por el polimorfismo respondedor alto/respondedor bajo (HR/LR) de FcRIIa, denominado después de la capacidad de las células T procedentes de algunos individuos para responder a la mitogénesis inducida por IgG1 murina (Tax et al, 1983). Más tarde, se encontró que los dos intercambios en la secuencia de aminoácidos entre la forma LR y la forma HR modifican la capacidad para unirse a IgG2 humana, lo que conduce a la hipótesis de que al menos una de ellas está implicada en la unión a IgG (Hogarth et al, 1992).

La solicitud de patente europea EP 0321842 describe la expresión de FcR soluble en agua, muy bioactivo, en células derivadas de organismos multicelulares, y su uso. Este FcR se puede unir a IgE, y evita la unión de IgE a eosinófilos. Por lo tanto, este receptor controla los efectos inflamatorios de la alergia. Además, es adecuado para el tratamiento o profilaxis de reacciones locales o alérgicas inducidas por IgE.

Galon et al. (Immunology Letters, 44 (1995) 175-181) describen receptores FcR solubles, su expresión en diferentes tipos de células eucariotas (v.g., infocitos, macrófagos), y su papel en las respuestas inmunitarias.

Sondermann et al. (The EMBO Journal, Vol. 18, nº 5, p. 1095-1103 (1999)) describen la estructura cristalina de FcRIIb soluble. Se muestran los diferentes dominios que son necesarios para la unión a IgG. Además, los autores proponen un modelo para el complejo sFcRIIb:IgG.

También es descrita por Sondermann y Jacob (Biol. Chem., Vol. 380, p. 717-721, (1999)) la expresión de la parte extracelular de FcRIIb humano en E. coli. Después de la expresión, el receptor se purificó, se caracterizó y se estudió para determinar la actividad de unión a anticuerpos y a IgG. Adicionalmente, el receptor se cristalizó.

En contraste con el papel beneficioso que juegan los FcR en el individuo sano, también transmiten la estimulación del sistema inmunitario en las alergias (FcRIa) o enfermedades autoinmunitarias. Además, algunos virus emplean FcR para tener acceso a las células, como el VIH (Homsy et al, 1989) y el dengue (Littaua et al, 1990), o ralentizan la respuesta... [Seguir leyendo]

1. Preparación cristalina de un receptor de Fc o Fc soluble recombinante, caracterizándose dicho receptor por la ausencia de dominios transmembránicos, péptido señal y glucosilación, y obteniéndose mediante expresión de un ácido nucleico que codifica tal receptor en procariotas.

2. Preparación cristalina según la reivindicación 1, en la que el receptor es de origen humano.

3. Preparación cristalina según la reivindicación 1 ó 2, en la que la misma contiene una de las secuencias de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO: 3 y 4.

4. Preparación cristalina de un complejo de receptor de Fc o Fc soluble recombinante/inmunoglobulina, en la que el receptor de Fc o Fc soluble es según las reivindicaciones 1 a 3.

5. Uso de datos de la estructura cristalina obtenibles a partir de un receptor de Fc o Fc soluble recombinante, y/o a partir de un complejo de un receptor de Fc o Fc soluble recombinante y su inmunoglobulina correspondiente, en un programa de obtención de modelos asistido por ordenador, usando una preparación cristalina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la identificación y/o generación de inhibidores del receptor de Fc o Fc que son complementarios al receptor de Fc o Fc soluble recombinante, inmunoglobulinas mutadas que son capaces de unirse a los receptores de Fc o Fc, y de este modo evitan la unión normal entre los FcR y las partes constantes de los anticuerpos, receptores de Fc o Fc, y/o inhibidores de inmunoglobulinas que son complementarios al sitio de unión de inmunoglobulina del receptor de Fc o Fc soluble recombinante, en el que dicho receptor de Fc o Fc se caracteriza por la ausencia de dominios transmembránicos, péptido señal y glucosilación, y se obtiene mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica tal receptor en procariotas.

6. Un método para la identificación y/o preparación producción de inhibidores del receptor de Fc o Fc o de inmunoglobulinas, así como receptores de Fc o Fc o inmunoglobulinas mediante mutagénesis, que comprende las etapas de

(i) proporcionar una preparación cristalina de un receptor de Fc o Fc soluble recombinante, caracterizándose dicho receptor por la ausencia de dominios transmembránicos, péptido señal y glucosilación, y siendo obtenible mediante expresión de un ácido nucleico que codifica tal receptor en procariotas,

(ii) usar la preparación cristalina obtenida de (i) para la generación de datos estructurales tridimensionales, y

(iii) seleccionar y diseñar, basándose en los datos estructurales obtenidos en (ii),

(a) inhibidores que son complementarios al sitio de unión del receptor de Fc o Fc para inmunoglobulinas;

(b) inhibidores que son complementarios al sitio de unión de inmunoglobulinas para receptores de Fc o Fc;

(c) receptores de Fc o Fc que se pueden usar como antagonistas y competidores.