Una proteína relacionada con el SRAG aislada que tiene una secuencia como se expone en la SEC ID Nº 1

INFORMACIÓN DE LA SOLICITUD ANTERIOR

Esta solicitud reivindica la prioridad de los documentos USSN 60/462.688, presentado el 15 de abril de 2003, y USSN 60/472.416, presentado el 22 de mayo de 2003.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a proteínas novedosas aisladas a partir de un paciente con síndrome respiratorio agudo grave (SRAG). La invención se refiere también a los usos de dichas proteínas en la terapia y el diagnóstico del SRAG.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La reciente identificación clínica de un tipo novedoso de neumonía atípica sin una etiología claramente definida, junto con la evidencia epidemiológica de un alto coeficiente de transmisión, han provocado que la Organización Mundial de la Salud emita una rara alerta de viaje. La nueva entidad se ha denominado síndrome respiratorio agudo grave (SRAG); aparentemente comenzó en la provincia de Guangdong en China en noviembre de 2002, y se ha extendido desde entonces a Hong Kong, Singapur, Vietnam, Canadá, EE.UU., Taiwán y varios países europeos. El brote en Canadá comenzó a finales de febrero de 2003 en un viajero que volvía desde Hong Kong, cuya exposición fue el caso inicial en la epidemia de Hong Kong (un médico que había tratado casos del SRAG en la provincia de Guangdong de la República Popular de China). El caso inicial canadiense murió 9 días después del inicio de la enfermedad y un pariente masculino de 43 años enfermó 2 días después de la exposición y murió de síndrome de dificultad respiratoria aguda 15 días después del inicio de la dolencia (1). Posteriormente, Canadá se ha enfrentado al mayor brote del SRAG fuera de Asia, con al menos 303 casos probables y sospechosos y 24 muertes, la mayoría en la zona de Toronto (2).

Se han remitido muestras de pacientes con sospecha o probabilidad de SRAG en Canadá al Laboratorio nacional de microbiología, Ministerio de sanidad de Canadá “National Microbiology Laboratory (NML), Health Canada”, para diagnóstico de laboratorio. Este laboratorio, parte del Centro canadiense de ciencias para la salud humana y animal “Canadian Science Centre for Human and Animal Health”, es el centro de referencia nacional de Canadá para enfermedades infecciosas, y alberga las únicas instalaciones de contención de clase 4 del país. El NML ha desempeñado un papel activo en un intenso esfuerzo cooperativo internacional entre 11 laboratorios de todo el mundo que ha sugerido que puede estar etiológicamente implicado un coronavirus preciso. En particular, el laboratorio preparó muestras nucleotídicas para el primer esfuerzo exitoso de determinar la secuencia genómica del coronavirus (3), un resultado pronto confirmado por otros laboratorios; véase, por ejemplo, la ref. (4).

No obstante, la secuencia genómica proporciona meramente un molde para la construcción de las proteínas víricas. Por tanto, una estrategia alternativa es examinar las proteínas mismas, y la espectrometría de masas ha probado ser una herramienta eficaz con este fin (5).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han aislado y secuenciado proteínas novedosas a partir de una muestra biológica de un paciente con síndrome respiratorio agudo grave (SRAG).

Según una realización de la divulgación, se proporciona una proteína relacionada con el SRAG a partir de un paciente de SRAG. En una realización específica, la proteína relacionada con el SRAG tiene la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº 1) o 2 (SEC ID Nº 2).

Esta divulgación está también dirigida al uso de proteínas relacionadas con el SRAG, o un fragmento de las mismas, para la preparación de una vacuna para tratar el SRAG.

Esta divulgación está dirigida al uso de proteínas relacionadas con el SRAG, o un fragmento de las mismas, para la preparación de anticuerpos, incluyendo anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o un fragmento funcional de los mismos. Esta divulgación se refiere también a los anticuerpos así producidos.

Esta divulgación está dirigida también a vacunas preparadas a partir de dichos anticuerpos, o proteínas relacionadas con el SRAG o un fragmento de las mismas, para el tratamiento o la prevención de enfermedades mediadas por virus, preferiblemente mediadas por coronavirus.

Esta divulgación está dirigida al uso de dichos anticuerpos o proteínas relacionadas con el SRAG, o un fragmento de las mismas, como diagnóstico para cribar la presencia del SRAG.

Esta divulgación está dirigida al uso de una proteína relacionada con el SRAG, o un fragmento de la misma, como herramienta de desarrollo de fármacos.

La divulgación está dirigida adicionalmente a un método de tratamiento de una afección asociada a un virus, preferiblemente un coronavirus, que comprende administrar a una célula o animal necesitado de ello una cantidad eficaz de un agente que module la expresión y/o actividad de una proteína relacionada con el SRAG de la invención. En una realización preferida, la afección a tratar es el SRAG.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Estos y otros rasgos de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción, en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos a la misma, en los que:

La Figura 1 muestra la secuencia aminoacídica de la proteína relacionada con el SRAG de 47 kDa (SEC ID Nº 1).

La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica de la proteína relacionada con el SRAG de 139 kDa (SEC ID Nº 2).

La Figura 3 muestra el análisis de proteínas de un nuevo coronavirus asociado al SRAG. A) Se separaron mediante PAGE-SDS las partículas víricas sedimentadas a partir del sobrenadante de células Vero E6 expuestas a muestras derivadas de pacientes con SRAG (carriles 1) o de células infectadas ficticiamente procesadas de forma similar (carriles 2), y se analizaron por transferencia Western con suero de convaleciente de pacientes de SRAG (Tor 2, Tor 3, Tor 4 y BC 1) o un suero de control de un donante no infectado (NML). Los sueros de los pacientes, pero no del control, reaccionaron con una especie de 44-48 kDa presente en los sobrenadantes de cultivos infectados pero no de los tratados ficticiamente (indicados por una flecha). B) Se fraccionó en un gradiente de sacarosa una muestra de virus similar a la descrita en A). Se separó la fracción que contenía material inmunorreactivo en un gel en gradiente de bisacrilamida de 4-12% y se tiñó con azul de Coomasie coloidal. Se observó una banda destacada con un peso molecular aparente de 44-48 kDa junto con una mucho menos intensa a ~180 kDa (indicada por una flecha). Se extrajeron estas bandas y se usaron para los estudios de espectrometría de masas descritos en el texto.

Figura 4. A) Espectro de EM individual de la mezcla peptídica obtenida a partir de la digestión tríptica de la proteína de 47 kDa antes del fraccionamiento por HPLC. B) Una sección pequeña del espectro de masas MALDI de una mezcla de péptidos trípticos de la proteína de 47 kDa. C) La misma sección del espectro obtenida a partir de la fracción 23 de la separación por HPLC de la mezcla. Las leyendas de pico indican los números de resto correspondientes a la proteína intacta; en un caso, se indica una pérdida de 64 Da. El pico intenso correspondiente a T277-293 en la mezcla está ausente en la fracción 23 (eluye en la fracción 21), pero varios picos más débiles que están presentes, como T389-405, se potencian significativamente por la HPLC. La mejora ayuda a identificarlos, y es esencial para una alta exactitud de la masa y para el posterior análisis de EM/EM. Las masas medidas y predichas para todos los péptidos trípticos pueden encontrarse en la Tabla 2; la Dm es menor de 10 mDa en casi cada caso.

Figura 5. Espectro de EM/EM del fragmento tríptico de m/z 2297 después de digestión en una mezcla 50/50 de agua normal y marcada con 0-18. Se muestra el espectro completo en A, con la secuencia aminoacídica indicada entre los fragmentos de la serie y. Se muestra en B un ejemplo de un fragmento de la serie b y en C un fragmento de la serie y. Es visible en C el patrón isotópico característico de fragmentos que contienen el extremo C. Las masas medidas y predichas para todos los picos identificados se muestran en la Tabla 1.

La Figura 6 muestra el alineamiento de secuencia de la proteína de nucleocápsida de coronavirus.

Figura 7. Detección directa por EM (A, B) y EM/EM (C) de péptidos trípticos glucosilados de la... [Seguir leyendo]

1. Una proteína relacionada con el SRAG aislada que tiene una secuencia como se expone en la SEC ID Nº 1.

2. Un anticuerpo reactivo contra una proteína según la reivindicación 1.

3. Un método de detección de un coronavirus o de una afección asociada a un coronavirus que comprende

5 ensayar en una muestra (a) la proteína relacionada con el SRAG según la reivindicación 1, o un fragmento inmunogénico de la misma, o (b) un anticuerpo que se une a la proteína relacionada con el SRAG según la reivindicación 1.

4. Un método según la reivindicación 3, que comprende poner en contacto una proteína relacionada con el

SRAG de la reivindicación 1, o un fragmento inmunogénico de la misma, con la muestra y determinar la presencia de 10 anticuerpos de la proteína relacionada con el SRAG en la muestra.

5. Un método según la reivindicación 3, que comprende poner en contacto el anticuerpo de la reivindicación 2 con la muestra y determinar la presencia de proteína relacionada con el SRAG en la muestra.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la afección es SRAG.

7. Un reactivo que comprende una cantidad de (a) una proteína relacionada con el SRAG según la

15 reivindicación 1, o un fragmento inmunogénico de la misma, o (b) un anticuerpo que se une a una proteína relacionada con el SRAG según la reivindicación 1 mezclado con un diluyente o portador adecuado.

8. Un método de cribado de un compuesto capaz de unirse a una proteína según la reivindicación 1, o un fragmento inmunogénico de la misma, que comprende poner en contacto la proteína, o fragmento de la misma, con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo de unirse a dicha proteína o fragmento de la misma.