Una partícula recombinante del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF) insertada en el genoma vírico,

de modo que la glicoproteína de la VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula de VSV recombinante, para uso como una vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF

Vacunas de virus recombinantes de la estomatitis vesicular contra las fiebres hemorrágicas.

Campo del invento

El presente invento se refiere, en general, al campo de las respuestas inmunes protectoras y los virus recombinantes.

Fundamento del invento

El virus de la estomatitis vesicular (VSV; del inglés, vesicular stomatitis virus) es un virus de RNA de cadena negativa no segmentada y pertenece a la familia Rhabdoviridae, genero Vesiculovirus. Su estructura sencilla y su rápido crecimiento con altos títulos en tipos celulares de mamífero y muchos otros tipos celulares han hecho de él una herramienta preferente para los biólogos moleculares y celulares en los últimos 30 años. Esto se vio incluso reforzado con el establecimiento del sistema de genética inversa para el VSV (Schnell et al., 1996).

Los virus de la fiebre hemorrágica vírica (VHF; del inglés, viral hemorrhagic fever) son prototipos de agentes patógenos emergentes/reemergentes. Las infecciones son asuntos de salud pública serios no sólo en países endémicos en desarrollo sino también en muchos países no endémicos desarrollados. Algunas de ellas representan una amenaza para la población mundial y, por lo tanto, son incluidas en la lista de la categoría A de agentes para bioterrorismo. En el pasado, el alto nivel de contención biológica necesario para su manipulación ha impedido estudios sobre virus tales como el virus Lassa y los virus Marburg (MBG) y Ébola (EBO). Aunque estos virus pueden ser desarrollados en cultivo tisular, la propagación del virus es normalmente lenta y los títulos son bajos en comparación con otros agentes patógenos víricos.

Aunque no hay vacunas autorizadas mundiales para los virus con nivel IV de contención, ha habido un reciente comunicado relativo a que primates no humanos fueron protegidos de la infección por Ébola mediante una inmunización con DNA/adenovirus (Sullivan et al., 2000). Esta estrategia de vacunación requería varias inyecciones de DNA desnudo tanto a la glicoproteína (GP) como a la nucleoproteína (NP) del virus Ébola, seguidas de la inyección de un adenovirus que expresaba el gen para GP de Ébola. Sin embargo, la vacuna protectora de primates no humanos requería múltiples dosis de DNA desnudo y refuerzo adenovírico para alcanzar la protección y, en el virus Ébola, la dosis utilizada para estimular a los monos era sólo 6 unidades formadoras de placas, lo que es muy poco. En general, el uso de esta vacuna para responder rápidamente a brotes epidémicos o actos de bioterrorismo está limitado porque se requieren exactamente 8 semanas para completar el programa de inmunización.

Los sistemas de genética inversa, tal como el VSV (Schnell et al., 1996), pueden ofrecer una posibilidad para superar algunas de las limitaciones y pueden ser realmente útiles para estudiar las etapas tempranas de la replicación, tal como la entrada del virus, en el contexto de una partícula vírica. Ya se han utilizado diferentes sistemas de seudotipos para estudiar el papel de la glicoproteína del virus Ébola en la entrada celular (Takada et al., 1997; Wool-Lewis, 1998; Yang et al., 2000). De una manera similar, se usó un sistema de seudotipo de VSV para estudiar las propiedades funcionales de la glicoproteína del virus Ébola y para explorar además anticuerpos neutralizantes contra dicha glicoproteína (Ito Hiroshi et al., Journal of Virology 75 (3): 1576-1580, 02-2001). Sin embargo, el uso de partículas de seudotipo está limitado a una infección de una sola etapa y, por lo tanto, sigue siendo artificial. Los virus recombinantes serían más realistas y potentes para estudiar el papel durante la replicación in vitro e in vivo. La capacidad del genoma de VSV para tolerar genes/unidades de transcripción adicionales hace que este sistema sea adecuado para la expresión de proteínas extrañas a alto nivel. Su manejo es relativamente poco complicado y, en general, son fácilmente aplicables planteamientos virológicos.

El objeto de nuestro estudio fue producir partículas de VSV recombinantes que expresaran glicoproteínas transmembranales y solubles procedentes de virus de alta contención con la idea de estudiar su papel en la replicación vírica, la patogénesis vírica y la inducción de la respuesta inmune del huésped. Aquí se describe la generación de varias partículas de VSV recombinantes y la caracterización de su fenotipo biológico.

Sumario del invento

De acuerdo con un primer aspecto del invento, se proporciona una partícula recombinante del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF) insertada en el genoma vírico, de modo que la glicoproteína de la VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula de VSV recombinante, para uso como una vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.

De acuerdo con un segundo aspecto del invento, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende genoma recombinante del virus de la estomatitis vesicular y un gen de la glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF), en que el gen de la glicoproteína de la VHF ha sustituido al gen nativo de la glicoproteína de VSV, para uso en la generación de una vacuna, molécula de ácido nucleico que codifica una partícula, para uso como una vacuna, que es infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - Sistema genético inverso para VSV. Diagrama esquemático del rescate de VSV. Células renales de cría de hámster que expresaban constitutivamente la polimerasa del bacteriófago T7 (BHK-T7) fueron transfectadas con un plásmido para la expresión de la síntesis de cRNA de VSV, controlada por el promotor de la RNA polimerasa de T7 y plásmidos de soporte y la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV; del inglés, hepatitis delta virus), que codifica las proteínas de la RNP.

Figura 2. Infección por VSV G MBG GP. (A) Se muestra el efecto citopatogénico (CPE; del inglés, cytopathogenic effect) en células Vero E6 infectadas, por microscopía de contraste de fase, 24 horas después de la infección. (B) Tinción de células Vero E6 infectadas, por inmunofluorescencia, con un anticuerpo específico para MBG GP1. Micrografías electrónicas que muestran VSV G MBG GP, VSVwt [VSV de tipo silvestre (del inglés, wild type)] y VSV G Lassa GP.

Figura 3. Curvas de crecimiento de VSV recombinante. Se infectaron células Vero E6 con A) VSVwt, VSV EBO sGP, MBG GP1 y con B) VSVwt, VSV G EBO GP y VSV G Lassa GP con una multiplicidad de infección (MOI; del inglés, multiplicity of infection) de 10. Se recogieron los sobrenadantes en los momentos indicados y se titularon para definir la "dosis infecciosa en cultivo tisular" [(TCID)₅₀; del inglés, tissue culture infectious dose].

Figura 4. Expresión de glicoproteínas expresadas por VSV recombinante. Se infectaron células Vero E6 con el VSV recombinante con una MOI de 10. A) VSV G MBG GP: 24 horas después de la infección, las proteínas fueron marcadas por impulsos durante 30 minutos con 740 kBq/ml de [³⁵S]-cisteína y fueron perseguidas durante 6 horas. Las proteínas específicas de GP fueron inmunoprecipitadas de los productos de lisis celulares con inmunoglobulinas anti-MBG GP, de ratón, y fueron analizadas por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS; del inglés, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) al 10% bajo condiciones reductoras. La presencia del decRVKR (25 mM) (un inhibidor de escisión) durante la marcación y la persecución anuló la escisión de preGP (carril 2). B) VSV G EBO GP: 24 horas después de la infección, las células fueron lisadas y fueron analizadas por transferencia Western con un anticuerpo específico para GP1 (carril 1) y un anticuerpo específico para GP2 (carril 2). C) VSV G Lassa G: 24 horas después de la infección, las células fueron lisadas y fueron analizadas por transferencia Western con un anticuerpo específico para G2. D-F) VSVwt (carril 1), VSV EVO sGP (carril 2), VSV MBG...

1. Una partícula recombinante del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF) insertada en el genoma vírico, de modo que la glicoproteína de la VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula de VSV recombinante, para uso como una vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.

2. La partícula de VSV recombinante de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la glicoproteína de la VHF es seleccionada del grupo que consiste en: una glicoproteína del virus Lassa, una glicoproteína del virus Marburg, una glicoproteína del virus Ébola, una glicoproteína del HFV Crimean-Congo, una glicoproteína del virus del dengue, una glicoproteína del virus Nipah, una glicoproteína del virus Hendra, una glicoproteína del virus Machupo, una glicoproteína del virus Junin, una glicoproteína del virus Guanarito y una glicoproteína del virus Sabia.

3. La partícula de VSV recombinante de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el primer gen del VSV recombinante codifica la glicoproteína de la VHF.

4. Una molécula de ácido nucleico que comprende genoma recombinante del virus de la estomatitis vesicular y un gen de la glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF), en que el gen de la glicoproteína de la VHF ha sustituido al gen nativo de la glicoproteína de VSV, para uso en la generación de una vacuna, molécula de ácido nucleico que codifica una partícula, para uso como una vacuna, que es infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.

5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 4, en que la glicoproteína de la VHF es seleccionada del grupo que consiste en: una glicoproteína del virus Lassa, una glicoproteína del virus Marburg, una glicoproteína del virus Ébola, una glicoproteína del HFV Crimean-Congo, una glicoproteína del virus del dengue, una glicoproteína del virus Nipah, una glicoproteína del virus Hendra, una glicoproteína del virus Machupo, una glicoproteína del virus Junin, una glicoproteína del virus Guanarito y una glicoproteína del virus Sabia.

6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 4, en que el primer gen del VSV recombinante codifica la glicoproteína de la VHF.