Adyuvantes peptídicos.

Una composición que comprende una cantidad eficaz de un adyuvante peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4) y un antígeno de interés.

Adyuvantes peptídicos Información anterior a la solicitud

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de EE. UU. 61/118.533, presentada el 28 de noviembre de 2008.

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a adyuvantes, composiciones inmunogénicas, y métodos útiles para la vacunación basada en polinucleótidos. La presente invención proporciona composiciones y métodos útiles para aumentar la respuesta inmunitaria, especialmente la respuesta inmunitaria humoral de vertebrados.

Antecedente de la invención Las composiciones vacunales incluyen a menudo adyuvantes inmunológicos para aumentar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund (CFA)  es un potente agente inmunoestimulante que se 20 ha utilizado satisfactoriamente con muchos antígenos sobre una base experimental. El CFA incluye tres componentes: un aceite mineral, un agente emulsionante, y micobacterias destruidas, tales como Mycobacterium tuberculosis. Las soluciones acuosas de antígeno se mezclan con estos componentes para crear una emulsión de agua en aceite. Aunque es eficaz como adyuvante, el CFA produce graves efectos secundarios, que incluyen dolor, formación de abscesos y fiebre, primariamente debidos a la presencia del componente de micobacteriano. El CFA,

por lo tanto, no se utiliza en vacunas humanas y veterinarias.

Los adyuvantes inmunológicos ayudan a aumentar las respuestas inmunitarias inducidas por las vacunas. Se han propuesto diferentes mecanismos para explicar el aumento de la respuesta inmunitaria específica al antígeno generada por la vacuna con el adyuvante. En primer lugar, el adyuvante puede proporcionar una liberación lenta del 30 antígeno exponiéndolo al sistema inmunitario durante un periodo de tiempo más largo y en consecuencia estimulando una respuesta inmunitaria más fuerte y mejor definida. En segundo lugar, el adyuvante puede ayudar también al suministro y captación del complejo antigénico por las células presentadoras de antígeno (APC)  tales como macrófagos y células dendríticas que a su vez pueden migrar a los órganos linfoides e iniciar una respuesta concertada con la interacción de células T y B. En tercer lugar, las células inmunitarias, incluyendo las APC, pueden 35 activarse directamente por el adyuvante e iniciar entonces una respuesta inmunitaria más rápida y más fuerte por medio de la estimulación posterior de las células T y B. La emulsión de aceite en agua ingerida por un macrófago que puede migrar entonces hacia los ganglios linfáticos de drenaje, o las moléculas estimulantes de TLR tales como el ADN que contiene dinucleótido CpG no metilado son ejemplos que actúan principalmente de acuerdo con estos mecanismos. Un paradigma interesante con respecto a la reacción inmunitaria es que las respuestas inmunitarias son más robustas en general cuando se estimulan por un antígeno que se produce raramente que cuando es por un antígeno que se encuentra más frecuentemente en la naturaleza. El presente estudio explora la posibilidad de utilizar secuencias peptídicas cortas que no están presentes o se han observado solo una vez en los proteomas conocidos como inmunomoduladores para aumentar las respuestas inmunitarias inducidas por vacunas y la protección contra infecciones víricas letales.

El documento US 6.100.380 se refiere a péptidos inmunomoduladores y desvela el uso de los pentapéptidos de fórmula R’  Glx  Glx  Lys  R" en la que Glx es Glu o Gln. En particular, esta patente proporciona los péptidos ThrAlaGluGluLys y ThrProGluGluLys. La solicitud PCT WO 1996/19494A1 se refiere a péptidos que tienen actividad inmunomoduladora y proporcionan el tetrapéptido HLysAsnProTyrOH y análogos del mismo como inmunomoduladores. En particular, el documento 50 WO 1996/19494A1 enseña el uso de dichos péptidos como un adyuvante vacunal.

Sumario de la invención De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para estimular una respuesta 55 inmunitaria a un antígeno que comprende la coadministración a un individuo que necesita de tal tratamiento de una cantidad eficaz de una composición que comprende un antígeno y un péptido con la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4) .

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una secuencia peptídica inmunoestimulante 60 que consiste en un péptido como se expone en la SEC ID Nº 4.

De acuerdo con un aspecto más de la invención, se proporciona una composición que comprende una cantidad eficaz de un adyuvante peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4)  y un antígeno de interés.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de estimulación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno que comprende la administración a un individuo que tiene la necesidad o el deseo de tal tratamiento de una cantidad eficaz de un adyuvante peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4) .

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un adyuvante peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4)  para estimular una respuesta inmunitaria o el aumento de la respuesta inmunitaria a un antígeno en un individuo que tiene la necesidad o desea tal tratamiento.

De acuerdo con un aspecto más de la invención, se proporciona un método para preparar un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria o aumentar una respuesta inmunitaria contra un antígeno que comprende la mezcla de una cantidad eficaz de un adyuvante peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4)  con un excipiente adecuado.

Breve descripción de los dibujos Figura 1: Ensayo de puntos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISPOT)  de la respuesta de células T después de la inmunización. Se vacunaron I.M. ratones BALB/c con 50 µg de una vacuna ADN pCAGαHA que contenía o bien: el péptido ajeno 5mero1 (CHKWD (SEC ID Nº1) ) , 5mero2 (WHKCE  (SEC ID Nº 2) ) , 5mero3 (CKWRC (SEC ID Nº 3) ) , 5mero4 (KWCEC (SEC ID Nº 4) ) , 5mero5 (DCWMD (SEC ID Nº 5) ) , 9mero1 (CWKCWCMFE (SEC ID Nº 6) ) , 9mero3 (WNWCMHWDC (SEC ID Nº 7) ) , 9mero4 (WHWCMMCWD (SEC ID Nº 8) ) , 13mero1 (HEHWCMMWHCCMI (SEC ID Nº 9) ) , 13mero3 (HMMCHWMCWCDMH (SEC ID Nº 10) ) , o 13mero4 (CHMMCHWMWCCMD (SEC ID Nº 11) )  fusionado al extremo carboxilo de HA. La pCAGαHA (50 ug)  representa la línea base de la respuesta de células T. Se agruparon los péptidos solapados que abarcaban la proteína HA 2005 Hanoi completa (10 péptidos/grupo)  y se utilizaron para reestimular los esplenocitos. Se recolectaron los esplenocitos a los 10 días de la vacunación y se reestimularon utilizando los grupos de péptidos derivados de HA. Los datos representan la frecuencia de puntos por millón de esplenocitos. Se analizaron 4 ratones por grupo. A partir de los datos se puede ver que no todos los péptidos hidrófobos producían una respuesta inmunitaria igual. Figura 2: Se hizo la respuesta de anticuerpo neutralizante después de la inmunización para detectar la presencia de anticuerpos en el suero que se esperaría para contrarrestar la infección. Se vacunaron I.M. los ratones BALB/c con 50 µg de vacuna ADN pCAGαHA que contenía o bien: el péptido ajeno 5mero1 (SEC ID Nº1) , 5mero2 (SEC ID Nº 2) , 5mero3 (SEC ID Nº 3) , 5mero4 (SEC ID Nº 4) , 5mero5 (SEC ID Nº 5) , 9mero1 (SEC ID Nº 6) , 9mero3 (SEC ID Nº 7) , 9mero4 (SEC ID Nº 8) , 13mero1 (SEC ID Nº 9) , 13mero3 (SEC ID Nº 10) , o 13mero4 (SEC ID Nº 11)  y HA. Los sueros recolectados de los ratones inmunizados se evaluaron por ensayos de neutralización. Para los ensayos de neutralización, se trató el suero durante una noche a 37 ºC con la enzima de destrucción del receptor  (RDE)  y luego se inactivó a 56 ºC durante 45 minutos. Se prepararon diluciones de dos veces seriadas de cada muestra, comenzando en la dilución 1:10, en diluyente de virus y se mezclaron con un volumen igual de aislado de virus de influencia homólogo utilizado para la inmunización (100 unidades formadoras de placas [PFU] por pocillo)  y se incubaron a 37 ºC durante 60 minutos. La mezcla se transfirió entonces a células MDCK en subconfluencia en placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante 510 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos de control se infectaron con una cantidad igual de vector vírico sin adición de suero o con suero no inmune de control. Se añadieron entonces 100 µl de diluyente vírico suplementado con 2, 0 µg/ml de tripsina TPCK a cada pocillo y se incubaron las placas a 37 ºC, un 5% de CO2... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una cantidad eficaz de un adyuvante peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4)  y un antígeno de interés. 5

2. Un método para preparar un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria o para aumentar una respuesta inmunitaria contra un antígeno que comprende la mezcla de una cantidad eficaz de un adyuvante peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos KWCEC (SEC ID Nº 4)  con un excipiente adecuado.

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