Composición inmunogénica que comprende una proteína espicular del coronavirus del SARS.

Composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende

a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido proteína espicular del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) SEQ ID NO:

6042, o

b) una secuencia de aminoácidos con >80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o

c) un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042;

a condición de que el polipéptido no sea MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAP.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere dos ácidos nucleicos y proteínas del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) . Estos ácidos nucleicos y proteínas pueden utilizarse en la preparación y fabricación de formulaciones de vacunas para el tratamiento o la prevención del SARS. También se describen reactivos de diagnóstico, kits (que comprenden tales reactivos) y métodos que pueden utilizarse para diagnosticar o identificar la presencia o ausencia de un virus del SARS en una muestra biológica. También se describen métodos para el tratamiento o la prevención del SARS mediante inhibidores virales de molécula pequeña y combinaciones de inhibidores virales de molécula pequeña y kits para el tratamiento del SARS.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el año 2003 se identificó en Hong Kong, China, y en varios otros países de todo el mundo un brote de un virus respiratorio virulento, actualmente conocido como síndrome respiratorio agudo grave (SARS) . Los pacientes presentaban por lo general síntomas que incluían fiebre, tos seca, disnea, dolor de cabeza e hipoxemia. Los aislados del virus del SARS parecen tener homología con al menos el gen de la ARN polimerasa de varios coronavirus conocidos. Se presenta un análisis filogenético de esta homología en Peiris et al., "Coronavirus as a possible cause of severe acute respirator y syndrome", Lancet, publicado online el 8 de abril de 2003 en http://image.thelancet.com/extras/03art3477web.pdf. Otros fragmentos secuenciados del genoma del virus del SARS parecen solaparse con el marco de lectura abierto 1b de los coronavirus. Véase, Drosten et al., "Identification of a Novel Coronavirus in Patients with Severe Acute Respirator y Syndrome", New England Journal of Medicine, publicado online en http://www.nejin.org el 10 de abril de 2003.

El Genome Science Center en la Columbia Británica, Canadá, publicó en su sitio web (http:///www.bcgsc.ca/bioinfo/SARS/) un borrador del montaje del genoma de 29.736 pares de bases de un virus que se creía era un virus del SARS, conocido como aislado TOR2.

El Centro para el Control de Enfermedades (CDC) publicó una secuencia de nucleótidos de una cepa del SARS-CoV en su sitio web (http://www.cdc.gov/ncidod/sars/pdf/nucleoseq.pdf) . El CDC también ha publicado un árbol filogenético de las proteínas N, S y M predichas (que se adjuntan como Figura 5) . Este árbol coloca el virus del SARS fuera de cualquiera de los grupos de coronavirus anteriormente conocidos.

En el documento WO 2004/089983 se describe un virus de ARN monocatenario de sentido positivo (SARS) , esencialmente de mamífero, aislado, dentro del grupo de los coronavirus y componentes del mismo. El número de registro AY323976 (base de datos EMBL) describe la glicoproteína espicular aislada ZJ01 del coronavirus del SARS. Ksiazek et al., 2003 (New England J Med, vol. 348, páginas 1953-1966) describen un nuevo coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave.

Existe una creciente necesidad de vacunas profilácticas o terapéuticas contra el virus del SARS.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende: la secuencia de aminoácidos del polipéptido proteína espicular del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) , SEQ ID NO: 6042, o una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; a condición de que el polipéptido no sea MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAP (como se describe en el documento WO 2004/089983) .

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6042, o una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; y que comprende adicionalmente un adyuvante. Se definen formas de realización adicionales en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIGURA 1: Esquema de la organización del genoma del coronavirus.

FIGURA 2: Esquema de los productos génicos ORF1a/ORF1b del coronavirus.

FIGURA 3: Alineamiento de las secuencias polipeptídicas del coronavirus (incluidas,

FIGURA 4: Alineamiento de las secuencias del polipéptido proteína espicular (S) , tomadas de la Figura 3, en la región del punto de unión de los dominios S1 y S2, y el sitio de escisión de la proteasa para los coronavirus seleccionados.

FIGURA 5: Ã?rbol filogenético del CDC de la cepa SARS-CoV (Clustalx 1.82, árbol de neighbor-joining) .

La Figura 5A muestra el análisis de la proteína N de coronavirus, la Figura 5B muestra el análisis de la proteína S de coronavirus y la Figura 5C muestra el análisis de la proteína M de coronavirus.

FIGURA 6: Etiquetas 229E: coronavirus humano; MEV: virus de la hepatitis murina; TGV: virus de la gastroenteritis transmisible; AIBV: virus de la bronquitis infecciosa aviar; BOVINO: coronavirus bovino; PEDV: virus de la diarrea epidémica porcina.

FIGURA 7: Predicción de superenrollamiento para la SEQ ID NO: 6042, utilizando el programa Coils (Figura 7A) o LeanCoil (Figura 7B) .

FIGURA 8: Ejemplo de inserción de un gen de interés indicador en un sitio entre los genes del virus del SARS existentes. Los productos de genes no estructurales pequeños no se representan esquemáticamente.

FIGURA 9: Esquema que representa muestras representativas de replicones del virus del SARS. Los productos de genes no estructurales pequeños no se representan esquemáticamente.

FIGURA 10: Organización del genoma del coronavirus del SARS. Se muestran las regiones replicasa y estructural, junto con los productos predichos de la escisión dentro de ORF1a y ORF1b. También se indican la posición de la secuencia líder (L) del ARN en 5', el tramo de poli (A) en 3' y la consenso de desplazamiento del marco de lectura ribosómico entre ORF1a y ORF1b. Cada recuadro representa un producto proteico. Están sombreados según el nivel de identidad de aminoácidos con las correspondientes proteínas de otros coronavirus. Los genes específicos de SARS están en color blanco. Las posiciones de las 9 secuencias IG de seis bases específicas de SARS (5'-ACGAAC-3’) se indican con flechas.

FIGURA 11: Organización del genoma de los coronavirus representativos del grupo 1 (HCoV-229E, número de registro: AF304460) , grupo 2 (virus de la hepatitis del ratón MHV, número de registro: NC_001846) , grupo 3 (virus de la bronquitis infecciosa aviar AIBV, número de registro: NC_001451) y coronavirus del SARS. Otros coronavirus completamente secuenciados utilizados en este estudio están disponibles en los siguientes números de registro: virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) , AF353511; virus de la gastroenteritis transmisible (TGV) , NC_002306; coronavirus bovino (BCoV) : AF220295. Los recuadros de color rojo representan genes específicos de grupo. La posición de la secuencia de ARN líder y del tramo de poli (A) también se indica en los genomas donde se notifican. La posición de las secuencias IG específicas se indica mediante círculos de diferentes tonos. En el genoma del SARS, también se descubrieron tres secuencias IG específicas para el coronavirus del grupo 2.

FIGURA 12: Modelo topológico predicho para la proteína espicular anclada a la membrana viral. Se indican los dominios funcional predicho y estructural. Se predijo que la región N-terminal (S1) contenía el dominio de unión al receptor. Se supone que dos regiones con superenrollamiento dentro del dominio S2, parcialmente superpuestas a los motivos con cremallera de leucina, están implicadas en la oligomerización. El dominio hidrófobo es responsable del anclaje a la membrana.

FIGURA 13: Ã?rbol filogenético obtenido a partir del alineamiento de secuencias múltiples de una región interna de 922 pb del gen pol de 12 coronavirus y SARS. Los números en los nudos representan el resultado de un análisis bootstrap y apoyan firmemente las ramificaciones. Las secuencias no disponibles dentro de los genomas de coronavirus completos se han recuperado a partir del GenBank en los siguientes números de registro: virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (PHEV) , AF124988, virus OC43 humano (OC43) , AF124989, coronavirus canino (CCV) , AF124986, virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) , AF124987, coronavirus del pavo (TCV) , AF124991, virus de la sialodacrioadenitis de la rata (SDAV) , AF124990.

FIGURA 14: 14A. Ã?rbol no enraizado obtenido a partir del alineamiento... [Seguir leyendo]

1. Composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende

a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido proteína espicular del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) SEQ ID NO: 6042, o b) una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o c) un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; a condición de que el polipéptido no sea MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAP.

2. Composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende

a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6042, o b) una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o c) un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; y que comprende adicionalmente un adyuvante.

3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polipéptido comprende: (a) una secuencia de aminoácidos con > 85% o > 90% o > 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042.

4. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polipéptido comprende un fragmento de al menos 25, o al menos 40, o al menos 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido está aislado y purificado a partir del virus del SARS.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido está producido mediante expresión recombinante.

7. Composición según la reivindicación 6, en la que el fragmento comprende cualquiera de las secuencias polipeptídicas proporcionadas en las SEQ ID NO: 7197, 7198, 7199 y 8041-8280.

8. Composición según la reivindicación 6 en la que el polipéptido es una proteína de fusión.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que la proteína de fusión comprende uno o más de los siguientes:

a) el dominio S1 (SEQ ID NO: 7307) , b) dominio S2 (SEQ ID NO: 7308) , c) la región de unión al receptor del dominio S1, d) las regiones dominio de oligomerización del dominio S2, e) la región cremallera de leucina del dominio S2, f) la región de anclaje a la membrana del dominio S2, g) la región dominio hidrófobo del dominio S2 h) la región cola citoplasmática del dominio S2, y/o i) cualquiera de las secuencias polipeptídicas proporcionadas en las SEQ ID NO: 7193-7194, 7196-7199, 7207-7223, 7398, 7399 y 8041-8280.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el polipéptido está en forma oligomérica.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que el oligómero está en forma trimérica.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en la que la proteína de fusión comprende

a) una secuencia marcadora, b) una segunda proteína del virus del SARS, c) una proteína de un virus no SARS, d) una proteína bacteriana y/o e) un adyuvante.

13. Composición según la reivindicación 12, en la que la proteína de un virus no SARS se deriva de un coronavirus, virus de la gripe, rinovirus, virus de la parainfluenza (PIV) , virus respiratorio sincicial (RSV) , adenovirus y/o metapneumovirus.

14. Composición según la reivindicación 12, en la que la proteína bacteriana es una proteína de adhesión bacteriana

o fragmento de la misma, tal como NadA, YadA, UspA2 o una proteína similar a NadA.

15. Composición según la reivindicación 2, o según las reivindicaciones 3-14 cuando dependen de la reivindicación

2, en la que el adyuvante está seleccionado de entre: sales minerales, emulsiones de aceite, formulaciones de

5 saponina, derivados bacterianos o microbianos, inmunomoduladores humanos, bioadhesivos o mucoadhesivos, micropartículas, liposomas, formulaciones de éter de polietileno y éster de polietileno, PCPP, péptidos muramilo,

compuestos de imidazoquinolona y/o virosomas o partículas pseudovirales.

16. Composición según la reivindicación 15, en la que el adyuvante es una toxina de ribosilación de ADP bacteriana

detoxificada, una forma doble mutante no tóxica de toxoides de Bordella pertussis, quitosano, MF59, aluminio, una

sal de aluminio o un inmunomodulador de molécula pequeña (SMIP) .

15

25

35

45

55