PROTEÍNAS RECOMBINANTES QUE CONTIENEN TOXINA DE TIPO SHIGA Y FRAGMENTOS DE FACTOR DE CRECIMIENTO VASCULAR ENDOTELIAL.

Ácido nucleico aislado codificante de una proteína de fusión, que comprende:

(1) la subunidad A de la toxina bacteriana de tipo Shiga, y (2) factor de crecimiento vascular endotelial humano, en el que dicha proteína de fusión presenta actividad inactivadora de los ribosomas

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas recombinantes de ácidos nucleicos y a proteínas de fusión recombinantes, y más particularmente a proteínas de fusión de toxina de tipo Shiga-factor de crecimiento vascular endotelial y a moléculas recombinantes de ADN codificante de dichas proteínas de fusión. Asimismo, la presente invención se refiere a vectores de expresión que contienen las moléculas recombinantes de ácidos nucleicos anteriormente indicadas, a métodos para producir las proteínas de fusión anteriormente indicadas, y a su utilización en tratamientos terapéuticos.

2. Descripción de la técnica relacionada

La angiogénesis es un procedimiento estrechamente controlado de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (ver Folkman y Shing, 1992; Hanahan, 1997, para revisiones). Bajo circunstancias normales, la angiogénesis se produce únicamente durante el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y el desarrollo del cuerpo lúteo. Sin embargo, la angiogénesis se produce en un gran número de patologías, tales como el crecimiento de tumores sólidos y la metástasis, en diversas enfermedades de los ojos, en estados inflamatorios crónicos y en daños isquémicos (ver Folkman, 1995, para una revisión). De esta manera, las células endoteliales en crecimiento presentan dianas únicas para el tratamiento de varias patologías mayores.

El regulador positivo crucial de la angiogénesis es el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), también conocido como factor de permeabilidad vascular (ver Neufeld, 1999, para revisiones). El VEGF es una glucoproteína dimérica secretada que, como resultado del procesamiento alternativo, podría consistir de polipéptidos con 121, 145, 165, 189 y 206 residuos aminoácidos. El VEGF es expresado por células normales y tumorales y el control de la expresión de VEGF aparentemente se encuentra regulado en varios niveles (ver Claffey y Robinson, 1996; Veikkola y Alitalo, 2000, para revisiones). La expresión de VEGF resulta regulada positivamente en respuesta a la hipoxia y la privación nutricional, sugiriendo la existencia de un bucle de retroalimentación entre el crecimiento tumoral y de metástasis y la capacidad de las células tumorales de inducir respuestas angiogénicas del huésped.

La acción de VEGF sobre las células endoteliales se encuentra mediada por la tirosina quinasa flt-1 y los receptores KDR/flk-1, también denominados VEGFR-1 y VEGFR-2 (ver Terman y Dougher-Vermazen, 1996; Veikkola et al., 2000, para una revisión). Estos receptores se expresan preferentemente en células endoteliales. Se ha publicado que las células endoteliales en los sitios de angiogénesis expresan un número significativamente más alto de receptores KDR/Flk1 que las células endoteliales quiescentes (Brown et al., 1993, 1995; Plate et al., 1993; Detmar et al., 1994; Couffinhal et al., 1997). Los receptores son proteínas tirosina quinasa transmembranales unipaso que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y que contienen siete bucles de tipo Ig en el dominio extracelular y comparten homología con el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas. La unión de VEGF a estos receptores induce la dimerización de los receptores, seguido de la fosforilación de las tirosinas de los dominios SH2 y SH3 en el dímero (ver Neufeld et al., 1994, para una revisión). El complejo KDR/Flk1-VEGF resulta internalizado mediante endocitosis mediada por receptores (Bikfalvi et al., 1991).

Varios grupos han informado de que el tratamiento dirigido del VEGF o de KDR/flk-1 inhibe la angiogénesis y los procesos dependientes de la angiogénesis (Kim et al., 1993; Millauer et al., 1994; Saleh et al., 1996; Aiello et al., 1995). Por otra parte, la inyección directa de VEGF o de un plásmido codificante de VEGF en tejidos isquémicos en un sistema modelo estimula el desarrollo de la microvasculatura y mejora la recuperación tras el daño isquémico o la angioplastia con balón (Asahara et al., 1996). Conjuntamente, estos resultados dejan pocas dudas de que VEGF y KDR/Flt1 desempeñan funciones cruciales en la angiogénesis. Aunque estos experimentos proporcionan una "prueba de principio" de que los conjugados de VEGF-toxina o las proteínas de fusión podrían funcionar in vivo, el desarrollo posterior de los constructos DT-VEGF se pone en duda debido a la toxicidad renal y hepática de las proteínas de fusión que contienen DT (ver, por ejemplo, Vallera et al., 1997).

Debido a que VEGF se une específicamente a las células endoteliales, este factor de crecimiento proporciona una oportunidad única para la administración dirigida de fármacos en los sitios de la angiogénesis. Se ha demostrado que las formas catalíticamente activas de la toxina diftérica unidas covalentemente o fusionadas mediante tecnología de ADN recombinante a VEGF165 y/o VEGF121 recombinantes resultan selectivamente tóxicas para las células que expresan receptores KDR/flk-1 y también suprimen la angiogénesis in vivo (Ramakrishnan et al., 1996; Olson et al., 1997; Arora et al., 1999).

Resulta ventajoso utilizar VEGF para direccionar toxinas que son "asesinas naturales" de las células endoteliales. La toxina 1 de tipo Shiga producida por E. coli O157:H7 es una de los "asesinos naturales" de las células

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endoteliales. El daño a las células endoteliales causado por las toxinas 1 de tipo Shiga desempeña un papel causativo en la patogénesis de la colitis hemorrágica (HC) y en el síndrome urémico hemolítico (HUS) inducido por E. coli O157:H7 (Obrig et al., 1987, 1993; Richardson et al., 1988; Kaplan et al., 1990).

La toxina 1 de tipo Shiga (SLT-1) está compuesta de una única copia de una subunidad A de 32 kDa asociada a un pentámero en forma de anillo de subunidades B de 7 kDa ligantes de receptores. Las subunidades B unen las SLTs al receptor celular globotriaosilceramida, conocido como Gb3 (Obrig et al., 1993). Este receptor se encuentra en muchos tipos celulares, incluyendo las células endoteliales (Obrig et al., 1993). Tras la unión al receptor de superficie celular, la SLT resulta endocitada y la subunidad A se corta en las formas A1 (27,5 kDa) y A2 (4,5 kDa) que se encuentran unidas mediante un enlace disulfuro (Olsness et al., 1981). La subunidad A procesada es una Nglucosidasa específica que inactiva los ribosomas al escindir un único residuo de adenina en la posición 4.324 desde el extremo 5'-terminal del ARNr 28S de la subunidad ribosómica 60S (Saxena et al., 1989). El corte de A4324 del ARNr 28S inactiva los ribosomas mediante la inhibición de la unión del factor de elongación complejo (EF1)/aminoacil-ARNt a los ribosomas, resultando en la inhibición de la síntesis de las proteínas. Al igual que con otros agentes inactivadores de los ribosomas, los efectos citostáticos y citotóxicos posteriores pueden surgir como respuesta celular a la inactivación de una proporción relativamente reducida de ribosomas a través de la respuesta de estrés ribotóxico (Iordanov et al., 1997). Alternativamente, podrían surgir efectos citostáticos y citotóxicos como respuesta celular a un colapso masivo de la síntesis de proteínas debido a la inactivación de un gran número de ribosomas. Resulta importante que la subunidad A de longitud completa no procesada, así como diversas subunidades A truncadas conserven una actividad significativa de N-glucosidasa (Haddad et al., 1993; Al-Jaufy et al., 1994, 1995). Además, las proteínas de fusión que contienen subunidad A de longitud completa no procesada, así como diversas subunidades A truncadas fusionadas al extremo N-terminal de CD4 conservan actividad de N-glucosidasa y son citotóxicas para las células que expresan el complejo gp120-gp41 del VIH (Al-Jaufy et al., 1994, 1995).

Debido a que la toxina de tipo Shiga es una asesina "natural" de las células endoteliales, resulta ventajoso administrar subunidad A enzimática activa de longitud completa, truncada o mutada en células endoteliales con el fin de inhibir su crecimiento y/o eliminarlas. Para evitar daños a otros tipos celulares, la subunidad A enzimáticamente activa de longitud completa, truncada o mutada debe ser transportada a las células diana por un factor de crecimiento específico de las células endoteliales tal como VEGF. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos eficaces de ADN recombinante para la producción de proteínas de fusión que contengan subunidad A enzimáticamente activa de longitud completa, truncada o mutada fusionada con VEGF de longitud completa, truncada o mutado que conserve la capacidad de unirse a receptores... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico aislado codificante de una proteína de fusión, que comprende:

(1) la subunidad A de la toxina bacteriana de tipo Shiga, y

(2) factor de crecimiento vascular endotelial humano,

en el que dicha proteína de fusión presenta actividad inactivadora de los ribosomas.

2. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de fusión se une específicamente a receptores del factor de crecimiento vascular endotelial.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, en el que dicha proteína de fusión resulta internalizada por una célula que expresa dichos receptores.

4. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 3, en el que dicha internalización se produce mediante endocitosis.

5. Polipéptido aislado que comprende:

(1) la subunidad A de la toxina bacteriana de tipo Shiga y

(2) el factor de crecimiento vascular endotelial humano,

en el que dicho polipéptido aislado presenta actividad inactivadora de los ribosomas.

6. Polipéptido aislado según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido aislado se une específicamente a los receptores del factor de crecimiento vascular endotelial.

7. Polipéptido aislado según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido aislado resulta internalizado por una célula que expresa dichos receptores.

8. Polipéptido aislado según la reivindicación 5, en el que dicha internalización se produce mediante endocitosis.

9. Vector de expresión, que comprende:

(1) un ácido nucleico codificante de una proteína de fusión que comprende la subunidad A de la toxina bacteriana de tipo Shiga y factor de crecimiento vascular endotelial humano, presentando dicha proteína de fusión actividad inactivadora de los ribosomas,

(2) una secuencia promotora operativamente ligada a dicho ácido nucleico para permitir la expresión de dicho ácido nucleico.

10. Vector de expresión según la reivindicación 9, en el que dicha proteína de fusión se une específicamente a receptores del factor de crecimiento vascular endotelial.

11. Vector de expresión según la reivindicación 10, en el que dicha proteína de fusión resulta internalizada por una célula que expresa dichos receptores.

12. Célula bacteriana transformada con el vector de expresión según la reivindicación 10.

13. Método in vitro de inactivación de ribosomas en una célula que expresa receptores del factor de crecimiento vascular endotelial humano, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la célula in vitro con una proteína de fusión que comprende:

(1) la subunidad A de la toxina bacteriana de tipo Shiga y

(2) el factor de crecimiento vascular endotelial humano, bajo condiciones

que permiten que dicha proteína de fusión resulte internalizada en dicha célula, e inactivar los ribosomas en dicha célula, presentando dicha proteína de fusión actividad inactivadora de los ribosomas.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha proteína de fusión se une específicamente a receptores del factor de crecimiento vascular endotelial.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha proteína de fusión resulta internalizada por una célula que expresa dichos receptores.

16. Composición para inhibir el crecimiento de las células endoteliales en un paciente, que comprende:

(A) una proteína de fusión que comprende la subunidad A de la toxina bacteriana de tipo Shiga, y factor de crecimiento vascular endotelial humano, presentando dicha proteína de fusión actividad inactivadora de los ribosomas, y

(B) un portador farmacéuticamente aceptable.

17. Composición que comprende una proteína de fusión que comprende la subunidad A de la toxina bacteriana de tipo Shiga y el factor de crecimiento vascular endotelial humano, presentando dicha proteína de fusión actividad inactivadora de los ribosomas; y un portador farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que sufre una afección fisiopatológica que depende de la angiogénesis.