PROMOTORES MUTANTES DE AOX 1.

Un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris del promotor de AOX1 de Pichia pastoris de tipo silvestre (SEC ID.

Nº: 1) que comprende al menos una mutación dentro de los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719) de la Sec. ID N:º: 1 para una expresión elevada en condiciones inducidas por metanol

Promotores mutantes de AOX1.

La presente invención se refiere a promotores mutantes de AOX1 de Pichia pastoris.

S. cerevisiae ha dominado (y aún domina) el uso científico y biotecnológico como organismo modelo eucariota y sistema de producción. En el siglo pasado otra levadura ganó gran atracción: la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. Debido a su cualidad de reproducirse únicamente mediante fisión, S. pombe recibió excelente atención como organismo modelo y actualmente, junto con S. cerevisiae, es la especie de levadura más intensamente estudiada, en cuanto a genética molecular y biología celular. Entre más de 700 especies de levaduras diferentes conocidas hasta la fecha, las dos levaduras mencionadas anteriormente pueden proporcionar solamente una serie limitada de cualidades interesantes para aplicaciones tecnológicas y científicas. Desde los años 1970 ó 1980 se investigaron cada vez más especies de levaduras con características sobresalientes para biotecnología e investigación. Estas levaduras, denominadas no-convencionales (NCY) o levaduras no-Saccharomyces (en este caso el término Saccharomyces incluye a la levadura Schizosaccharomyces pombe) se desarrollan por varias razones: poseen importancia médica, como Candida albicans, o relevancia tecnológica, como Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis, pueden crecer sobre sustratos particulares (por ejemplo, n-alcanos, lactosa). Por ejemplo, el patógeno fúngico de seres humanos más común, C. albicans se ha estudiado ampliamente ya que revela la naturaleza de los factores de virulencia implicados en la patogenia, convirtiéndose, por tanto, en el organismo modelo para levaduras patógenas. Otro grupo bien establecido de NCY son las levaduras metilotróficas Pichia pastoris y Hansenula polymorpha (Pichia angusta) que son superiores a S. cerevisiae en cuanto a producción de proteínas recombinantes y estudios de biogénesis de peroxisomas. Estos son sólo los miembros más destacados de levaduras no-convencionales que siguen teniendo atracción académica o tecnológica. Hasta la fecha otras muchas especies también tienen particular interés y este grupo crecerá rápidamente en los próximos años.

Todas las levaduras conocidas utilizan azúcares, la clase más abundante de moléculas en la naturaleza. Aunque existen grandes diferencias en cuanto a la aceptación del sustrato de una especie a otra (véase la Tabla 1), la transformación de glucosa 6-fosfato o fructosa 6-fosfato a piruvato es un tema común en su metabolismo. De todos modos, el equipo enzimático de la ruta glucolítica varía significativamente entre las diferentes levaduras. Mientras que en S. cerevisiae, la mayoría de las enzimas se conocen y se caracterizan, al menos parcialmente, sólo unas pocas enzimas se describen en las NCY. Algunas de las funciones necesarias para la glucólisis están mediadas por varios genes/enzimas en algunas levaduras, especialmente aquellas que desempeñan un papel adicional en el control o en la regulación del metabolismo y/o que son un punto de ramificación como glucoquinasa/hexoquinasa, fosfofructoquinasa y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Normalmente, las isoenzimas se regulan diferencialmente lo que indica diversas funciones en requisitos previos ambientales cambiantes. Algunos de los genes que codifican enzimas glucolíticas son constitutivos y están sumamente expresados, por ejemplo, el gen de PGK1 (fosfoglicerato quinasa) de S. cerevisiae o el gen de GAP (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) de P. pastoris, mientras que otras enzimas se regulan rigurosamente como el gen de ENO1 (enolasa) de S. cerevisiae.

En el metabolismo, el destino del piruvato varía significativamente entre especies de levaduras y condiciones de cultivo. En S. cerevisiae y otras levaduras denominadas Crabtree positivas, la respiración se inhibe por glucosa y azúcares relacionados. Esto conduce a la transformación del piruvato, mediante la piruvato descarboxilasa, en etanol y en CO₂, incluso con grandes cantidades de oxígeno, lo que también se conoce como fermentación. En las levaduras Crabtree negativas, a las que pertenecen la mayoría de las NCY, la transformación del piruvato en etanol se produce sólo en condiciones anaerobias. En condiciones aerobias, el piruvato se oxida a CO₂ mediante la piruvato deshidrogenasa y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). El ciclo del TCA es de interés excepcional para el metabolismo celular debido al hecho de que es el único modo de realizar la oxidación de los azúcares a CO₂. La oxidación a CO₂ da como resultado la producción de NADH, que se usa para la producción de energía. Además los productos intermedios del ciclo del TCA son las principales fuentes de metabolitos para fines biosintéticos. Debido a la eliminación de los productos intermedios, el ciclo del TCA debe reponerse para mantenerlo en funcionamiento. Las principales reacciones anapleróticas en levaduras son el ciclo de la piruvato carboxilasa y el del glioxilato. El primero es la ruta principal cuando se cultivan en amonio como única fuente de nitrógeno mientras que el segundo es necesario cuando se cultivan en fuentes de carbono con menos de 3 átomos de carbono. A diferencia de este notable interés, se sabe muy poco sobre los genes o las enzimas que participan en el ciclo del TCA en las NCY. El NADH generado por las reacciones catabólicas, tanto en el citosol como en las mitocondrias, tiene que re-oxidarse a NAD⁺ para mantener en funcionamiento a las reacciones. En levaduras Crabtree negativas (por ejemplo, Pichia pastoris) en condiciones aerobias, el NADH se re-oxida, principalmente, a través de la cadena respiratoria. La situación es significativamente diferente en levaduras Crabtree positivas, como S. cerevisiae, en las que existe conjuntamente la respiración y la fermentación. Cuando se cultivan en glucosa en condiciones aerobias, la glucosa reprime la respiración y se produce la fermentación. En estas condiciones el NAD⁺ se regenera por la formación de etanol (el NADH producido por glucólisis) o glicerol. La respiración en levaduras difiere del paradigma de esta ruta en animales, como se describe en cada libro de texto de bioquímica. En primer lugar, algunas levaduras, como S. cerevisiae y Kluyveromyces lactis, carecen de complejo I de la cadena respiratoria. En estas levaduras la regeneración del NAD⁺ se realiza sin bombeo de protones a través de la membrana mitocondrial interna por NADH deshidrogenasas externas e internas. La segunda diferencia principal, observada en las levaduras Crabtree negativas, hongos y plantas, es una ruta de respiración alternativa en paralelo al complejo III y IV de la cadena del citocromo. Esta respiración alternativa está mediada por una oxidasa denominada alternativa que transfiere electrones directamente desde la reserva de ubiquinona al oxígeno sin bombeo de protones a través de la membrana mitocondrial interna.

EL NADPH se produce, con fines biosintéticos, en la parte oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato (PPP). Otros metabolitos muy importantes proporcionados por esta ruta son, ribosa 5-fosfato y eritrosa 4-fosfato, necesarios para la síntesis de ácidos nucleicos y cofactores de nucleótidos y para la síntesis de aminoácidos aromáticos, respectivamente. Todavía quedan muchas lagunas en cuanto a la información sobre los genes y sus correspondientes enzimas implicadas en la PPP en levaduras no convencionales. Se aislaron algunas enzimas de Candida utilis, S. pombe y K. lactis. La caracterización en cuanto a composición y cinética reveló varias diferencias entre estas enzimas. Debido a la falta de información no puede calcularse la influencia sobre la PPP en estas levaduras, pero se ha observado que, por ejemplo, mutantes de fosfoglucosa isomerasa de K. lactis, que carecen de glucólisis, pueden cultivarse en medios con glucosa, a diferencia de S. cerevisiae. Esta observación indica que la capacidad de la ruta de la pentosa fosfato en K. lactis es suficiente para el cultivo en glucosa como fuente de carbono. En levaduras metilotróficas, pudo encontrarse... [Seguir leyendo]

1. Un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris del promotor de AOX1 de Pichia pastoris de tipo silvestre (SEC ID. Nº: 1) que comprende al menos una mutación dentro de los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719) de la Sec. ID N:º: 1 para una expresión elevada en condiciones inducidas por metanol.

2. El promotor de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el promotor comprende adicionalmente una mutación de los nucleótidos 694 a 723 (-260 a - 231) y/o de los nucleótidos 729 a 763 (-225 a -191) de la Sec ID Nº1 y/o de un sitio de unión a factores de transcripción (TFBS) y/o al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 170 a 191 (-784 a -763), los nucleótidos 192 a 213 (-762 a -741), los nucleótidos 192 a 210 (-762 a -744), los nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745), los nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), los nucleótidos 304 a 350 (-650 a -604), los nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561), los nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), los nucleótidos 509 a 551 (-445 a -403), los nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), los nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), los nucleótidos 621 a 660 (-333 a -294), los nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), los nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213), los nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216), los nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), los nucleótidos 784 a 800 (-170 a -154) o los nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93).

3. El promotor de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que la mutación es una deleción, una sustitución, una inserción o una inversión.

4. El promotor de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado por que el sitio de unión a factores de transcripción (TFBS) se selecciona del grupo que consiste en Hap1, Hsf, Hap234, abaA, Stre, Rap1, Adr1, Mat1MC, Gcr1 y QA-1F, en el que el sitio de unión a factores de transcripción (TFBS) Hap1 comprende preferiblemente los nucleótidos 54 a 58 de la Sec ID Nº. 1, Hsf los nucleótidos 142 a 149 y 517 a 524 de la Sec ID Nº.1, Hap234 los nucleótidos 196 a 200, 206 a 210 y 668 a 672 de la Sec ID Nº.1, abaA los nucleótidos 219 a 224 de la Sec ID Nº: 1, Stre los nucleótidos 281 a 285 de la Sec ID Nº: 1, Rap1 los nucleótidos 335 a 339 de la Sec ID Nº: 1, Adr1 los nucleótidos 371 a 377 de la Sec ID Nº: 1, Mat1MC los nucleótidos 683 a 687 de la Sec ID Nº: 1, Grc1 los nucleótidos 702 a 706 de la Sec ID Nº: 1 y QA-1F los nucleótidos 747 a 761 de la Sec ID Nº: 1.

5. Una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína (péptido) o un ácido nucleico funcional, caracterizado por que dicho promotor y dicho ácido nucleico están unidos operativamente entre sí formando un casete de expresión unicopia o multicopia.

6. Un vector que comprende un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula que comprende al menos un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, al menos un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o al menos un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que dicha célula es una célula eucariota, en particular una célula de levadura, preferiblemente una célula de levadura metilotrófica, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en Candida, Hansenula, Pichia y Toruplosis, en particular una célula de Pichia pastoris.

9. Un kit para la expresión de una proteína seleccionada que comprende