Un procedimiento para producir un derivado de glutamato, incluyendo formas salinas del mismo,

de la fórmula general (2) en la que R 1 representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, y R 2 representa un grupo hidroxilo, en presencia de una transaminasa que cataliza una reacción para producir el derivado de glutamato de la fórmula general (2) a partir de un ácido α-ceto sustituido de la siguiente fórmula general (1) en la que R 1 representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, y R 2 representa un grupo hidroxilo, que incluye una etapa de proseguir la reacción

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir derivados de glutamato por el uso de reacciones de enzima. Además, la invención se refiere a un 5 procedimiento para producir monatina útil como un agente edulcorante, a partir de triptófano

como uno de los aminoácidos utilizados como un material de inicio.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

(3-(1-amino-1,3-dicarboxi-3-hidroxi-butan-4-il)-indol) del ácido 4-(indol-3-ilmetil)-4hidroxi-glutámico (denominado en adelante "monatina") representado por la siguiente fórmula estructural (6) es uno de los aminoácidos contenidos en la raíz de un arbusto, Schlerochitom ilicifolius en Sudáfrica, y tiene un nivel de dulzura varios cientos de veces mayor que la sacarosa. Por lo tanto, la monatina es un compuesto particularmente prometedor como un edulcorante de bajas calorías (véase JP-A-64-25757).

**(Ver fórmula)**

15 ácido (4-indol-3-ilmetil)-4-hidroxi-glutámico La monatina tiene carbonos asimétricos en las posiciones 2 y 4. La monatina natural está en la configuración estérica de (2S, 4S). Con respecto a la presencia de sus estereoisómeros de tipo no natural, además, se confirma la presencia de tres tipos de tales estereoisómeros sintéticamente preparados. No sólo la monatina de tipo natural sino que

20 también todos los otros estereoisómeros tienen niveles de dulzura individual y altamente enriquecidos. Por lo tanto, se espera que uno cualquiera de estos o una mezcla de varios pueda utilizarse como un agente edulcorante o un componente para agentes edulcorantes (edulcorante). Como el procedimiento de producción de monatina, se informaron cinco ejemplos en el pasado. Los detalles son los descritos en las siguientes referencias de la técnica relacionada.

(1) Specification of USP No. 5994559

(2) Tetrahedron Letters, 2001, Vol. 42, No. 39, pp. 6793-6796

(3) Organic Letters, 2000, Vol. 2, No. 19, pp.2967-2970

(4) Synthetic Communication, 1994, Vol. 24, No. 22, pp. 3197-3211 30 (5) Synthetic Communication, 1993, Vol. 23, No. 18, pp. 2511-2526.

Sin embargo, todos estos procedimientos requieren múltiples etapas. Aún no se ha establecido procedimiento sintético de monatina alguno a una escala de producción industrial. Por lo tanto, se desea el desarrollo de un procedimiento industrial para producir derivados de glutamato que incluyen monatina y análogos de la misma en una forma simple con un alto rendimiento.

EP 0.692.539 describe un procedimiento para producir un ácido γ-hidroxi-L-glutámico ópticamente activo permitiendo la coexistencia de un biocatalizador, un donante de un grupo amino, ácido pirúvico y ácido glioxílico en un medio acuoso. En una realización alternativa, el ácido γ-hidroxi-L-glutámico ópticamente activo se forma permitiendo la coexistencia de un biocatalizador, un donante de un grupo amino, y un ácido 4-hidroxi-2-cetoglutárico ópticamente activo en un medio acuoso.

Hélaine et al., 1999 describen el ácido (2S,4R)-4-propil glutámico análogo del ácido glutámico, y la producción enzimática del mismo por el uso de una transaminasa glutámico oxalacética. Como sustratos de esta transaminasa, se mencionan ácidos 4-alquil-αcetoglutáricos.

Hélaine et al., 2001 describen la síntesis de ácidos L-glutámicos 4,4-disustituidos por transaminación enzimática por el uso de transaminasa glutámico oxalacética.

Winter and Dekker, 1989 discuten la especificidad de la aspartato aminotransferasa a partir de plantas leguminosas para ácidos glutámicos 4-sustituidos. El documento concluye con que la transaminación de ácidos glutáricos 2-oxo-4-sustituidos no está involucrada en la biosíntesis de los ácidos glutámicos 4-sustituidos correspondientes en estas especies e informa la ineficiencia de la transaminación de ácidos glutámicos 4-sustituidos por asparato aminotransferasa.

Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar un procedimiento eficiente para producir derivados de glutamato (que incluyen formas salinas del mismo) tales como monatina promisoria como un componente para edulcorantes y análogos de los mismos.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

En tales circunstancias, los inventores de la presente han llevado a cabo investigaciones. Por consiguiente, han logrado exitosamente la producción de un derivado de glutamato (que incluye formas salinas de mismo) de la fórmula general (2)

**(Ver fórmula)**

(R1 y R2 en la fórmula general (2) tienen el mismo significado que R1 y R2 en la fórmula general (1)) en presencia de una transaminasa que cataliza la reacción para producir el derivado de glutamato de la fórmula general (2) a partir de un ácido α-ceto sustituido de la

**(Ver fórmula)**

(en la fórmula general (1), R1 representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, y R2 representa un grupo hidroxilo = 3 que incluye una etapa de proseguir la reacción. Con base en este hallazgo, se ha logrado la invención.

El procedimiento para producir derivados de glutamato de acuerdo con la invención permite la producción eficiente de monatina representada por la siguiente fórmula (6) a partir de ácido 4-(indol-3-ilmetil)-4-hidroxi-2-oxoglutárico (denominado en adelante “IHOG”) representado por la siguiente fórmula (7), por el uso de la reacción de transaminasa.

**(Ver fórmula)**

ácido 4-(indol-3-ilmetil)-4-hidroxi-glutámico

Además, los inventores han desarrollado un nuevo procedimiento de producción de monatina que incluye las siguientes reacciones 1 a 3 a partir de un material de inicio triptófano, uno de aminoácidos, por el uso del procedimiento para producir derivados de glutamato de acuerdo con la invención. El procedimiento para producir derivados de glutamato de la presente invención corresponde a la reacción 3 en el procedimiento de producción de monatina

que incluye las siguientes reacciones 1 a 3. La vía de producción de monatina que incluye las

reacciones 1 a 3 se muestra en el esquema de reacción (8).

Reacción 1: preparar ácido indol-3-pirúvico a partir de triptófano en presencia de una

enzima.

Reacción 2: preparar el ácido ceto precursor (IHOG) vía la condensación de aldol entre

ácido indol-3-pirúvico y ácido pirúvico (o ácido oxaloacético).

Reacción 3: preparar sintéticamente monatina por aminación de IHOG en la posición 2

en presencia de una transaminasa.

**(Ver fórmula)**

En otras palabras, la invención puede describirse de acuerdo con lo presentado a continuación.

[1] Un procedimiento para producir un derivado de glutamato (que incluye formas salinas del mismo) de la fórmula general (2)

**(Ver fórmula)**

(R1 y R2 en la fórmula general (2) tienen el mismo significado que R1 y R2 en la fórmula

general (1)) en presencia de una transaminasa que cataliza una reacción para producir el

derivado de glutamato de la fórmula general

(2) a partir de un ácido α-ceto sustituido de la siguiente fórmula general (1)

**(Ver fórmula)**

(en la fórmula general (1), R1 representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, y R2 representa un grupo hidroxilo

[2] Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en [1], en el que el sistema de reacción para la transaminasa contiene uno o varios tipos de aminoácidos como donantes de grupos de aminoácidos.

[3] Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en [2], en el que los aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido glutámico, ácido aspártico, alanina, triptófano, fenilalanina, isoleucina, leucina, tirosina, valina, arginina, asparagina, glutamina, metionina, ornitina, serina, cisteína, histidina y lisina.

[4] Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en [1] a [3], en el que la enzima es una L-aminoácido transaminasa.

[5] Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en [1] a [3], en el que la enzima es una D-aminoácido transaminasa.

[6] Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en [5], en el que el sistema... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato, incluyendo formas salinas del mismo, de la fórmula general (2)

**(Ver fórmula)**

en la que R1 representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, y R2 representa un grupo hidroxilo, en presencia de una transaminasa que cataliza una reacción para producir el derivado de glutamato de la fórmula general (2) a partir de un ácido α-ceto sustituido de la siguiente fórmula general (1)

**(Ver fórmula)**

10 en la que R1 representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, y R2 representa un grupo hidroxilo, que incluye una etapa de proseguir la reacción.

2. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 1, en el que el sistema de reacción para la transaminasa contiene uno o varios tipos de aminoácidos como donantes de grupos de aminoácidos.

15 3. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 2, en el que los aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido glutámico, ácido aspártico, alanina, triptófano, fenilalanina, isoleucina, leucina, tirosina, valina, arginina, asparagina, glutamina, metionina, ornitina, serina, cisteína, histidina y lisina.

4. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito 20 en las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima es una L-aminoácido transaminasa.

5. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima es una D-aminoácido transaminasa.

6. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito

en la reivindicación 5, en el que el sistema de reacción para el mismo contiene una enzima con 25 una actividad que cataliza la reacción para convertir L-aminoácido en D-aminoácido.

7. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 4, en el que la L-aminoácido transaminasa es una enzima derivada de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en los géneros Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Beijerinckia, Escherichia, Proteus y Morganella.

5 8. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 7, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Aeromonas hydrophila, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes faecalis, Beijerinckia indica, Escherichia coli, Proteus rettgeri y Morganella morganii.

9. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito

10 en la reivindicación 5 o 6, en el que la D-aminoácido transaminasa es una enzima derivada de un microorganismo del género Bacillus o Paenibacillus.

10. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 9, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Bacillus sphaericus, Bacillus pulvifaciens, Bacillus macerans, Bacillus lentus, Paenibacillus

15 larvae subespcie pulvifaciens y Paenibacillus macerans.

11. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 1, en el que la enzima es una enzima generada por un microorganismo con el gen de la D-aminoácido transaminasa introducido en el mismo.

12. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito 20 en la reivindicación 11, en el que el microorganismo es Escherichia coli.

13. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 11 o 12, en el que el gen de la D-aminoácido transaminasa deriva de Bacillus sphaericus o Bacillus macerans.

14. El procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con cualquiera 25 de las reivindicaciones 1 a 13, que además incluye al menos la siguiente etapa [I]:

[I] Una etapa para producir un ácido α-ceto sustituido de la fórmula general (4)

**(Ver fórmula)**

en la que R representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, en presencia de una enzima que cataliza la reacción para producir el ácido α-ceto sustituido de la fórmula 30 general (4) a partir de un ácido α-ceto sustituido representado por la fórmula general (3)

**(Ver fórmula)**

en la que R representa un grupo fenilmetilo o un grupo 3-indolilmetilo, y ácido oxaloacético o ácido pirúvico, que incluye una etapa de proseguir la reacción.

15. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 14, en el que la enzima que cataliza la reacción en la etapa [I] deriva de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en los géneros Pseudomonas, Erwinia, Flavobacterium y Xanthomonas.

16. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 15, en el que el microorganismo es Pseudomonas taetrolens, Pseudomonas coronafaciens, Pseudomonas desmolytica, Erwinia sp., Flavobacterium rhenanum o Xanthomonas citri.

17. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 16, en el que el microorganismo es Pseudomonas taetrolens ATCC4683 o Pseudomonas coronafaciens AJ2791.

18. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 14, en el que la enzima que cataliza la reacción en la etapa [I] es cualquiera de las siguientes proteínas:

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 2 en el listado de secuencias;

(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos preparada por la sustitución, eliminación, inserción, adición y/o inversión de uno o varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Núm. 2 en el listado de secuencias que tienen la actividad de aldolasa;

(c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Núm. 3;

(d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos preparada por la sustitución, eliminación, inserción, adición y/o inversión de uno o varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Núm. 3 en el listado de secuencias que tienen la actividad de aldolasa.

19. Un procedimiento para producir un derivado de glutamato descrito en la reivindicación 14, en el que la enzima que cataliza la reacción en la etapa [I] es una enzima obtenida a partir de un recombinante en el que el gen que codifica cualquiera de las siguientes proteínas está amplificado y expresado:

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 2 en el listado de secuencias;

(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos preparada por la sustitución, eliminación, inserción, adición y/o inversión de uno o varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Núm. 2 en el listado de secuencias que tienen actividad de aldolasa;

(c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Núm.3;

(d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos preparada por la sustitución, eliminación, inserción, adición y/o inversión de uno o varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Núm. 3 en el listado de secuencias que tienen la actividad de aldolasa.

20. Un procedimiento para producir monatina que incluye al menos las siguientes etapas [A] a [C]:

[A] una etapa para producir ácido indol-3-pirúvico en presencia de una enzima que cataliza la reacción para convertir triptófano en ácido indol-3-pirúvico, permitiendo la reacción del triptófano;

[B] una etapa para producir ácido 4-(indol-3-ilmetil)-4-hidroxi-2-oxoglutárico a partir de ácido indol-3-pirúvico, y ácido oxaloacético o ácido pirúvico;

[C] una etapa para producir monatina en presencia de una transaminasa que cataliza la reacción para producir monatina a partir del ácido 4-(indol-3-ilmetil)-4-hidroxi-2-oxoglutárico, permitiendo la reacción del ácido 4-(indol-3-ilmetil)-4-hidroxi-2-oxoglutárico.

21. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 20, en el que la etapa [A] incluye permitir la reacción de triptófano en presencia de una enzima que cataliza la reacción para convertir triptófano en ácido indol-3-pirúvico produciendo así ácido indol-3-pirúvico, y la solución resultante se trata con cualquiera de un tratamiento de desaireación, tratamiento de desoxigenación y tratamiento de ajuste del pH hasta pH 2 como máximo para recolectar ácido indol-3-pirúvico.

22. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 21, en el que el tratamiento de desaireación o el tratamiento de desoxigenación es un procedimiento para sustituir la totalidad o una parte del gas contenido en la solución de reacción con un gas inactivo.

23. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 22, en el que el gas inactivo es cualquiera de nitrógeno, argón y helio.

24. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en las reivindicaciones 21 a 23, en el que el ajuste del pH se lleva a cabo por la adición de un ácido a

la solución de reacción, y el procedimiento además comprende una etapa de cristalización del ácido indol-3-pirúvico producido como una consecuencia del ajuste del pH y la recolección del ácido indol-3-pirúvico.

25. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 24, en el que el ácido es cualquiera de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido fosfórico.

26. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en las reivindicaciones 20 a 25, en el que la enzima que cataliza la reacción en la etapa [A] deriva de un microorganismo que tiene actividad de aminoácido oxidasa y actividad de catalasa.

27. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en las reivindicaciones 20 a 26, en el que la enzima que cataliza la reacción en la etapa [A] deriva de cualquiera de los géneros Achromobacter, Proteus y Morganella.

28. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 27, en el que la enzima deriva de cualquiera de Achromobacter sp. AJ2425, Proteus rettgeri IFO13501 y Morganella morganii IFO3168.

29. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en la reivindicación 20, en el que la etapa [A] comprende la interacción de un cultivo de un microorganismo con triptófano, en el que dicho microorganismo posee una capacidad para convertir triptófano en ácido indol-3-pirúvico y se selecciona de los géneros Achromobacter, Proteus, Morganella, Pseudomonas y Neurospora, y que además comprende la producción de ácido indol-3-pirúvico y después la recolección del ácido indol-3-pirúvico.

30. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en las reivindicaciones 20 a 29, en el que la etapa [B] se lleva a cabo en presencia de una enzima que cataliza la reacción.

31. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en las reivindicaciones 20 a 29, en el que la etapa [B] se lleva a cabo de acuerdo con un procedimiento químico sintético.

32. Un procedimiento para producir monatina de acuerdo con lo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 31, en el que la etapa [C] comprende un procedimiento descrito en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.