Un procedimiento para producir un virus Mononegavirales recombinante que comprende;

a) en al menos una célula huésped, realizar la transfección, en medio, de una composición de rescate que comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión que comprende una o más moléculas de ácido nucleico aislada que codifican las proteínas de acción trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación en condiciones suficientes para permitir la coexpresión de dichos vectores y la producción del virus recombinante; y b) calentar la composición de rescate transfectada hasta una temperatura de choque térmico eficaz en condiciones suficientes para aumentar la recuperación del virus recombinante

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para producir virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden designado virus Mononegavirales. Las realizaciones preferidas se refieren a procedimientos de producción de tales virus como virus atenuados y/o infecciosos tales como el virus del sarampión (VS), el virus respiratorio sincitial (VRS) y el virus paragripal humano (VPH). Los virus recombinantes pueden prepararse a partir de clones de ADNc y, por consiguiente, pueden obtenerse virus que tienen cambios definidos en el genoma.

Antecedentes de la invención

Los virus de ARN monocatenario de sentido negativo envueltos son excepcionalmente reconocidos y expresados. El ARN genómico de virus monocatenarios de sentido negativo cumple dos funciones de molde en el contexto de una nucleocápside: como molde para la síntesis de ARN mensajeros (ARNm) y como molde para la síntesis de la hebra de antigenoma (+). Los virus de ARN monocatenario de sentido negativo codifican y encapsidan su propia ARN polimerasa dependiente de ARN. Los ARN mensajeros sólo se sintetizan una vez que el virus ha entrado en el citoplasma de la célula infectada. La replicación vírica se produce después de la síntesis de los ARNm y requiere la síntesis continua de proteínas víricas. La hebra de antigenoma (+) recientemente sintetizada sirve de molde para generar otras copias de ARN genómico de hebra (-).

El complejo de la polimerasa actúa y consigue la transcripción y la replicación engranando las señales de acción cis en el extremo 3' del genoma, en particular la región promotora. Entonces, los genes víricos se transcriben desde el molde del genoma unidireccionalmente desde su extremo 3' hasta 5'. Siempre hay menos ARNm preparado a partir de los genes en la dirección 3' (por ejemplo, el gen de polimerasa (L)) con respecto a sus vecinos en la dirección 5' (es decir, el gen de nucleoproteína (N)). Por tanto, siempre hay un gradiente de abundancia de ARNm según la posición de los genes con respecto al extremo 3' del genoma.

El análisis genético molecular de tales virus de ARN no segmentado ha demostrado ser difícil hasta hace poco debido a que el ARN genómico desnudo o el ARN producido intracelularmente a partir de un plásmido transfectado no es infeccioso (Boyer y Haenni, 1994). Este problema técnico se ha superado mediante el desarrollo de tecnología de rescate de ADNc inteligente que permite el aislamiento de virus de ARN de hebra negativa no segmentado recombinante (Pattnaik y col., 1992; Schnell, Mebatsion y Conzelmann, 1994). Las técnicas para el rescate de estos diferentes virus de hebra negativa siguen un tema común, teniendo cada una componentes necesarios distintivos para el rescate satisfactorio (Baron y Barrett, 1997; Collins y col., 1995; Garcin y col., 1995; Hoffman y Banerjee, 1997; Lawson y col., 1995; Radecke y col.. 1995; Schneider y col., 1997; He y col., 1997; Schnell, Mebatsion y Conzelmann, 1994; Whelan y col., 1995). Después de la transfección de un plásmido de ADNc genómico se produce una copia exacta del ARN del genoma mediante la acción combinada de la ARN polimerasa T7 de fago y una secuencia de ribozimas codificada por vector que escinde el ARN para formar los extremos 3'. Este ARN está encapsidado y es replicado por proteínas víricas inicialmente suministradas por plásmidos de expresión cotransfectados. En el caso del sistema de rescate del virus del sarampión (VS) (Radecke y col., 1995) se preparó una línea celular estable que expresaba ARN polimerasa T7 y las proteínas N del VS (proteína de la nucleocápside) y P (subunidad de la polimerasa de fosfoproteína). Por tanto, el rescate del VS puede lograrse cotransfectando esta línea celular con un clon de ADNc genómico del VS que contiene un promotor de la polimerasa T7 apropiadamente posicionado y un plásmido de expresión que contiene el gen de la polimerasa del VS (L).

El rescate satisfactorio del ADNc del virus del sarampión requiere aparentemente que se produzcan numerosos acontecimientos moleculares después de la transfección que incluyen: 1) síntesis precisa de longitud completa del ARN del genoma por ARN polimerasa T7 y procesamiento del extremo 3' por la secuencia de ribozimas; 2) síntesis de proteínas N, P y L víricas a niveles apropiados parar iniciar la replicación; 3) la encapsidación de novo de ARN genómico en estructuras de la nucleocápside transcripcionalmente activas y competentes en la replicación; y 4) expresión de genes víricos a partir de nucleocápsides recientemente formadas a niveles suficientes para que progrese la replicación. Exactamente no se ha determinado qué etapas pueden ser limitantes de la velocidad en el rescate satisfactorio, pero la eficiencia del rescate puede mejorarse posiblemente estimulando una cualquiera de las etapas anteriormente mencionadas.

La presente invención busca mejorar la capacidad de recuperación de virus de ARN recombinantes deseados tales como el VS. Se sostiene que la capacidad para obtener el virus replicante a partir del rescate puede disminuir a medida que el polinucleótido que codifica el genoma nativo y el antigenoma de un virus deseado se modifica cada vez más. Por consiguiente, la presente invención busca superar un obstáculo tal ya que estos procedimientos

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pueden mejorar sustancialmente la probabilidad de obtener un virus recombinante deseado a partir de un procedimiento de rescate.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para producir un virus recombinante del orden Mononegavirales que comprende; (a) en al menos una célula huésped, realizar la transfección de una composición de rescate que comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión que comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de acción trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación en una célula huésped en condiciones suficientes para permitir la coexpresión de estos vectores y la producción del virus recombinante; (b) calentar la composición de rescate transfectada hasta una temperatura de choque térmico eficaz en condiciones suficientes para aumentar la recuperación del virus recombinante; y opcionalmente (c) recoger el virus recombinante resultante.

Un procedimiento adicional se refiere a producir un virus Mononegavirales recombinante que comprende; a) en al menos una célula huésped, realizar la transfección de una composición de rescate que comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión que comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica las proteínas de acción trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación en condiciones suficientes para permitir la coexpresión de dichos vectores y la producción del virus recombinante; b) transferir la composición de rescate transfectada sobre al menos una capa de células Vero; y opcionalmente recoger el virus recombinante.

Otros aspectos de la presente invención se refieren a procedimientos de combinar las etapas no solapantes de los procedimientos anteriores junto con realizaciones preferidas para crear otros procedimientos mejorados.

En realizaciones alternativas, la presente invención proporciona un procedimiento para hacer virus de ARN del orden Mononegavirales que son atenuados, infecciosos o ambos. Realizaciones adicionales se refieren a los virus producidos a partir de los procedimientos de la presente invención, además de vacunas que contienen tales virus. Se observa que tales virus pueden ser humanos o no humanos, tales como murinos o bovinos.

Las realizaciones anteriormente identificadas y las realizaciones adicionales que se tratan en detalle en este documento representan los objetos de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa un diagrama de flujo del procedimiento de rescate modificado. Este procedimiento incluye el uso de una etapa de choque térmico y la transferencia... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir un virus Mononegavirales recombinante que comprende;

a) en al menos una célula huésped, realizar la transfección, en medio, de una composición de rescate que comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión que comprende una o más moléculas de ácido nucleico aislada que codifican las proteínas de acción trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación en condiciones suficientes para permitir la coexpresión de dichos vectores y la producción del virus recombinante; y

b) calentar la composición de rescate transfectada hasta una temperatura de choque térmico eficaz en condiciones suficientes para aumentar la recuperación del virus recombinante.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además recoger el virus recombinante.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de choque térmico eficaz es superior a 37ºC.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de choque térmico eficaz está en el intervalo de 37ºC a aproximadamente 54ºC.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de choque térmico eficaz está en el intervalo de 38ºC a aproximadamente 49ºC.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de choque térmico eficaz está en el intervalo de 39ºC a aproximadamente 48ºC.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de choque térmico eficaz está en el intervalo de 41ºC a aproximadamente 47ºC.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células transfectadas se someten a la temperatura de choque térmico eficaz durante aproximadamente 5 a aproximadamente 300 minutos.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células transfectadas se someten a la temperatura de choque térmico eficaz durante aproximadamente 15 a aproximadamente 240 minutos.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células transfectadas se someten a la temperatura de choque térmico eficaz durante aproximadamente 15 a aproximadamente 200 minutos.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que después de la etapa (b) la composición de rescate transfectada se transfiere sobre al menos una capa de células Vero.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la capa de células Vero es una monocapa.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus del ARN del orden Mononegavirales es un virus humano, bovino o murino.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales es una quimera de más de una fuente de genoma o antigenoma.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales codifica un virus atenuado o una forma infecciosa del virus.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales codifica una forma infecciosa del virus.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales codifica un virus atenuado.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o

antigenoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado del orden Mononegavirales codifica un virus atenuado infeccioso.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de ARN es un virus de la familia de los Paramyxoviridae.

20. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de ARN es un virus de la familia de los Rhabdoviridae.

21. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de ARN es un virus de la familia de los Filoviridae.

22. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de ARN es un virus seleccionado del grupo que consiste en VS, VRS, VPH y VPB.

23. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de ARN es un virus VS.

24. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica genoma o antigenoma de un virus de ARN seleccionado del grupo que consiste en los virus VRS y las proteínas de acción trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación son N, P, L y M2.

25. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica genoma o antigenoma de VS y las proteínas de acción trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación N, P y L.

26. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica genoma o antigenoma de VPH-3 y las proteínas de acción trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación NP, P y L.

27. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped es una célula procariota.

28. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped es una célula eucariota.

29. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped es una célula de vertebrado.

30. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped es una E. coli.

31. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped se deriva de una célula humana.

32. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped se deriva de una célula embrionaria humana.

33. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped se deriva de una célula de riñón embrionario humano.

34. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el vector de transcripción comprende además un gen de polimerasa T7.

35. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición de rescate comprende además un virus colaborador sin modificar o modificado.

36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el virus colaborador proporciona un gen de polimerasa T7 para la transcripción de la secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de ARN monocatenario de sentido negativo no segmentado en el que la composición de rescate comprende además un virus colaborador modificado.

37. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el gen T7 está bajo el control regulador de un promotor tardío

o un promotor temprano/tardío.

38. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que el gen T7 está bajo el control regulador de un promotor temprano/tardío.

39. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que la transfección se realiza en presencia de un inhibidor de la síntesis de ADN.

40. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped para la transfección es una célula Vero.