Un polipéptido que comprende polipéptidos E6 y E7 del virus del papiloma humano,

en el que el polipéptido E7precede al polipéptido E6 y tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24 y 26 de laSEC ID Nº: 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106de la SEC ID Nº: 13.

Péptidos de fusión que comprenden los polipéptidos E7 y E6 de virus del papiloma humano y composiciones inmunogénicas de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas e inmunogénicas usadas para tratar o prevenir cáncer cervical y otros cánceres causados por virus del papiloma humano (VPH) . En particular, la presente invención se refiere a proteínas de fusión y los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas de fusión, usadas para generar respuestas inmunes frente a VPH. Estas proteínas y polinucleótidos de fusión se usan en el tratamiento y prevención de cánceres inducidos por VPH.

Antecedentes de la invención

El cáncer de cuello uterino es la segunda causa principal de muertes relacionadas con tumores en mujeres, representando 250.000 muertes por año en todo el mundo. Se sabe que más del 99 % de todos los cánceres cervicales están asociados con infección por virus del papiloma humano (VPH) , de los que el 50 % están ligados directamente con VPH de tipo 16 (VPH16) (Walboomers y col., J. Path. 1999, 189: 12-19) . Aunque la mayoría de las infecciones por VPH16 son sintomáticas y transitorias, un cierto porcentaje de ellas se hace persistente. Aproximadamente el 1 % de individuos infectados de forma persistente progresan a lesiones cervicales crecientemente graves conocidas como neoplasia intraepitelial cervical (CIN) , y con el tiempo a carcinoma cervical invasivo.

Las proteínas de VPH tempranas conocidas como E6 y E7 son necesarias para mantener el fenotipo maligno (Von Knebel y col., Int J Cancer 1992, 51: 831-4; Crook y col, Embo J 1989, 8: 513-9; He y Huang, Cancer Res. 1997, 57: 3993-9) . Estas proteínas se expresan uniformemente en lesiones de CIN y cánceres (Smotkin y Wettstein, Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83:4680-4; Durst y col, Virology 1992, 189: 132-40) . Estas proteínas inducen proliferación del epitelio interrumpiendo la regulación del ciclo celular. Específicamente E7 se une a e inactiva la proteína del retinoblastoma (Rb) supresora de tumores celulares (Dyson y col., Science 1989, 243: 934-7) , lo que da como resultado progresión de la célula a la fase S del ciclo celular (Cobrinik y col., Trends Biochem Sci 1992, 17: 312-5) . La proteína E6 de VPH16 induce degradación de la proteína supresora de tumores p53 (Scheffner y col., Cell 1990,

63: 1129-36) , evitando que la célula experimente apoptosis.

Debido a que las células tumorales expresan de forma constitutiva las proteínas E6 y E7, y estas proteínas no están presentes en células normales, estas proteínas virales son dianas muy atractivas para inmunoterapia de cáncer. Muchas líneas de pruebas sugieren que una respuesta inmune mediada por células contra E6 y E7 en seres humanos se correlaciona con la regresión natural de lesiones de VPH y eliminación de ADN viral (Nakagawa y col., J Infect Dis 1997, 175: 927-31; Kadish y col., J Natl Cancer Inst 1997, 89: 1285-93) . Además se ha mostrado que una respuesta de CTL contra E7 protege a los ratones contra tumores positivos contra tumores positivos para VPH16 en diferentes modelos murinos (Feltkamp y col., Eur J Immunol 1995, 25: 2638-42; Lin y col., Cancer Res 1996, 56: 216) .

Puesto que la inmunidad mediada por células (CMI) parece ser importante en el combate de infección por VPH y enfermedad (Eiben, G.L. y col., Adv Can Res 2002, 86: 113-148) , una vacuna terapéutica debería generar respuesta de linfocitos T óptimas frente a numerosos péptidos antigénicos E6 y E7 de VPH para una cobertura eficaz en poblaciones diversas de antígenos de leucocitos humanos (HLA) .

Un vector de vacuna prometedor para suministrar antígenos E6/E7 es un vector de alfavirus recombinante (AV) derivado de la cepa 3014 atenuada de virus de la encefalitis equina venezolana (VEE; Velders M.P. y col., Cancer Res 2001, 61: 7861-7867) . Se ha demostrado que partículas de replicón de VEE (VRP) incompetentes para replicación son vacunas altamente eficaces en varios modelos de tumor y enfermedad infecciosa preclínicos (Rayner, J.O. et al., Rev Med Virol 2002, 12: 279-296) . Los vectores de replicón derivado de AV tales como VEE codifica genes heterólogos en forma de ARN, no se expanden más allá de infección inicial e inducen apoptosis de células infectadas (Griffith, D.E. y col., Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51: 565-592) . Estos atributos limitan las oportunidades de expresión prolongada de proteínas o integración en el ADN huésped que son características de tumores malignos inducidos por VPH después de infección natural. La baja prevalencia de inmunidad anti-VEE preexistente y las posibilidades de inmunización repetida con VRP (Pushko, P. y col., Virology 1997, 239: 389-401) son ventajas frente a otros vectores virales recombinantes tales como virus vaccinia o adenovirus.

Boursnell M. y col. (Vaccine, 1996, vol. 14, número 16, páginas 1485-1494) desvelan virus vaccinia recombinantes que codifican proteínas de fusión E6-E7 de VPH16 y VPH18 con mutaciones de aminoácidos en los restos 24 y 26 de E7.

Bor y siewicz LK y col. (Lancet, 1996, vol. 347, número 9014, páginas 1523-1527) , desvelan para su uso como inmunoterapia para cáncer cervical virus vaccinia recombinante que codifica proteínas de fusión E6-E7 de VPH16 y VPH18 con mutaciones de aminoácidos en los restos 24 y 26 de E7.

El documento WO99/10375 desvela una vacuna que comprende una proteína de fusión E6-E7 de VPH con mutaciones de aminoácidos en los restos 24 y 26 de E7 unida con un compañero de fusión.

El documento US 6.004.557 desvela una vacuna que comprende una proteína de fusión E6-E7 de VPH16 en la que una o ambas de E7 y E6 puede tener una mutación de deleción.

Dalal S y col. (Journal of Virology, 1996, vol. 70, número 2, páginas 683-688) desvela VPH16 con mutaciones de aminoácidos en diversos restos, incluyendo los restos 63 y 106 de E6.

Edmonds C y col. (Journal of virology, 1989, vol. 63, número 6, 1989, páginas 2650-2656) desvelan VPH16 con mutaciones de aminoácidos en diversos restos, incluyendo los restos 24, 26 y 91 de E7.

Velders MP y col. (Cancer Research, 2001, vol. 61, número 21, páginas 7861-867) desvelan vacunación con vector de encefalitis equina venezolana recombinante que codifica la proteína E7 de VPH16 (sin mutaciones) .

Kast W y col. (Journal of Immunology, 1994, vol. 152, número 8, 1994, páginas 3904-3912) desvela la afinidad de unión de cinco alelos de HLA-A de un conjunto de todos los péptidos monoméricos posibles de proteínas E6 y E7 de VPH 16 para seleccionar candidatos a vacuna.

Murakami M y col. (Cancer Research, 1999, vol. 59, número 6, páginas 1184-187) , desvela la inducción de respuestas de CTL a proteínas E6 y E7 de VPH usando una proteína de fusión E6-E7 recombinante (sin mutaciones) y células dendríticas humanas autólogas.

Offringa y col. (Current Opinion in Immunology, 2000, vol. 12, número 5, páginas 576-582) , desvela vacunas que comprenden proteínas E6 y E7 de VPH que pueden mutarse para carecer de capacidad de transformación, como parte de un artículo de revisión sobre estrategias de vacuna contra el cáncer.

Aunque son dianas atractivas para inmunoterapia de cáncer, E6 y E7 tienen actividad transformante. En consecuencia, los procedimientos de inmunoterapia que usan E6 y E7 que se contemplan en la actualidad en la técnica son potencialmente arriesgados debido a que estas proteínas pueden inducir transformación e inmortalización de las células.

Sigue habiendo una necesidad no satisfecha de composiciones eficaces para el tratamiento y prevención de CIN y carcinoma cervical. Más específicamente, existe la necesidad de composiciones inmunogénicas incluyendo composición basada en E6 y/o E7, que son tanto seguras como eficaces para tratar y/o prevenir CIN, carcinoma cervical, carcinoma anal y otros trastornos tales.

Los estudios anteriores de composiciones inmunogénicas de VPH se han limitado por la falta de modelos tumorales que expresaran HLA de clase 1 en ratones. Se describe en el presente documento un modelo positivo de E6/E7 de VPH16; este modelo forma tumores de crecimiento progresivo en ratones transgénicos HLA-A*0201.

Sumario de la invención

La presente invención satisface las necesidades anteriormente descritas y otras proporcionando composiciones farmacéuticas y polipéptidos que comprenden fusiones de polipéptidos E6 y E7 que... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende polipéptidos E6 y E7 del virus del papiloma humano, en el que el polipéptido E7 precede al polipéptido E6 y tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24 y 26 de la SEC ID Nº: 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106 de la SEC ID Nº: 13.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el E7 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24, 26 y 91 de la SEC ID Nº: 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106 de la SEC ID Nº: 13.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 en el que los aminoácidos mutados están mutados a glicina.

4. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una célula huésped aislada que expresa el polipéptido de la reivindicación 1.

6. Una composición inmunogénica que comprende:

(a) el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable o;

(b) el ácido nucleico de la reivindicación 4.

7. La composición inmunogénica de la reivindicación 6 que comprende adicionalmente adyuvante.

8. Un virus recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

9. El virus recombinante de la reivindicación 8, en el que el virus es un virus de la encefalitis equina venezolana modificado.

10. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 9 o en la SEC ID Nº: 11.

11. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 4, que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 9 o en la SEC ID Nº: 11.

12. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 11 que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº: 10 o en la SEC ID Nº: 12.

13. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 4, 11 ó 12 bajo el control de una secuencia de control de la expresión.

14. Una célula huésped aislada que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4 o el vector de expresión de la reivindicación 13.

15. Uso de la composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 6 o el vector de expresión de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer cervical.

16. Uso de la composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 6 o el vector de expresión de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para prevenir cáncer cervical.