Vacuna que comprende

a) un virus MVA recombinante, que comprende un fragmento o fragmentos del ácido nucleico que codifica la proteína MSP-1 de Plasmodium falciparum;

y

b) un vehículo farmacológicamente aceptable,

en donde el fragmento de MSP-1 o los fragmentos de MSP-1 codificado(s) por el ácido nucleico se elige(n) exclusivamente de:

• p42;

• p42 y p38;

• p83, p30, p42 y p38

Cepas de MVA recombinantes como vacunas potenciales contra la malaria por P. falciparum.

Introducción

Aquí se describen la producción de virus vaccinia recombinantes de la cepa MVA (virus vaccinia Ankara modificado) para la producción recombinante del antígeno de la malaria gp190/MSP-1 completo del agente patógeno de la malaria Plasmodium falciparum así como dominios naturales individuales y partes de los mismos. Además la invención se refiere al uso de MVA recombinantes, que llevan la secuencia sintética de ADN del antígeno de la malaria así como partes de la misma integradas en el genoma vírico, como vacuna para la inmunización contra la malaria.

La malaria se cuenta entre las enfermedades infecciosas más graves del mundo. Según estimaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS) cada año se registran de 400 a 900 millones de episodios de la enfermedad. Según informaciones de la Iniciativa Multilateral contra la Malaria (MIM) cada año mueren entre 700.000 y 2,7 millones de personas por la infección (MIM, 2001). Además en 99 países el 40% de la población mundial está expuesta a riesgo de malaria. La enfermedad está causada por protozoos unicelulares del género Plasmodium del filo Apicomplexa. Hay cuatro especies que infectan a los seres humanos: Plasmodium malarieae, responsable de la fiebre cuartana, Plasmodium vivax y Plasmodium ovale, que causan ambos la fiebre terciana y finalmente Plasmodium falciparum, el agente patógeno de la malaria tropical y responsable después de todo de casi todas las infecciones mortales.

Actualmente su propagación aumenta de nuevo. Esto es debido sobre todo al desarrollo de una intensa resistencia del agente patógeno de la malaria, que es favorecida debido a que los medicamentos utilizados en la terapia son además recomendados y empleados para la profilaxis. Junto a la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos la investigación se concentra en el desarrollo de vacunas, que en el curso de las infecciones de malaria inducen mecanismos de inmunidad en seres humanos, que muestran una capacidad de resistencia aumentada contra los Plasmodium, como se muestra en el desarrollo de distintos tipos de inmunidad en seres humanos en las regiones epidémicas de malaria.

MSP-1 como vacuna potencial

MSP-1, la proteína principal de la superficie de los merozoítos, la forma invasora de la fase sanguínea del agente patógeno de la malaria, es una proteína de 190-220 kDa. Esta proteína se procesa más tarde durante el desarrollo de los merozoítos en fragmentos proteicos más pequeños, que hasta la invasión de eritrocitos por el parásito se encuentran como complejos anclados mediante un anclaje de glicosilfosfatidil-inositol sobre la superficie del merozoíto y se pueden aislar.

Las secuencias de las proteínas MSP-1 de distintas cepas de P. falciparum pertenecen a dos grupos, que se nombran según dos aislados representativos K1 y MAD20. En conjunto la proteína consta de varias regiones muy conservadas, de regiones dimorfas de las que se puede adjuntar respectivamente una de las dos y de dos bloques oligomorfos relativamente pequeños en la parte N-terminal de la proteína (Fig. 1, Tanabe et al., 1987).

La inmunización de ratones con la proteína purificada del parasito P. yoelii protegió a los animales de la en caso contrario infección mortal (Holder y Freeman, 1981). También la transferencia de anticuerpos monoclonales contra MSP-1 de P. yoelii proporcionó protección en un modelo de ratón (Majarian et al., 1984).

Además de los estudios en ratones también se inmunizaron monos Saimiri y Aotus con MSP-1 nativa purificada por inmunoafinidad. En estos experimentos la proteína obtenida de P. falciparum protegió de forma parcial (Perrin et al., 1984) o total (Siddiqui et al., 1987) contra la posterior infección con el parásito.

Una purificación del material nativo de Plasmodium es realmente costosa y no permite la producción a gran escala. Por lo tanto la investigación en vacunas se concentra en el desarrollo de vacunas recombinantes.

De esta manera se inmunizaron con éxito ratones con MSP-1-19 purificada de E. coli o Saccharomyces cerevisiae (Daly y Long, 1993; Ling et al., 1994; Tian et al., 1996; Hirunpetcharat et al., 1997), así como con Mycobacterium bovis que llevan MSP-1-19 (Matsumoto et al., 1999). De forma alternativa a la inmunización con proteínas nativas o recombinantes también se usó como vacuna el ADN codificante de MSP-1-19 y protegió a los ratones inmunizados de la infección con P. chabaudi (Wunderlich et al., 2000).

Las inmunizaciones de monos con MSP-1-19 y MSP-1-42 recombinantes de P. falciparum proporcionó protección parcial (Kumar et al., 1995; Egan et al., 2000; Chang et al., 1996; Stowers et al., 2001). La interpretación de los experimentos de inmunización en monos solo es realmente posible de forma limitada, ya que no se da un análisis estadístico de los resultados debido al pequeño número de animales de experimentación.

En estudios en fase I y II con fragmentos de MSP-1 como vacuna también se ha mostrado su inmunogenicidad en seres humanos. Se trata de p19 de P. falciparum fusionada a un epítopo de célula T auxiliar de la toxina del tétanos (Keitel et al., 1999) y los bloques 3 y 4 de MSP-1 (Saul et al., 1999; Genton et al., 2000).

Algunos estudios epidemiológicos en regiones endémicas mostraron una correlación en adultos entre los títulos de anticuerpo contra MSP-1 y la inmunidad contra la malaria (Tolle et al., 1993; Riley et al., 1992; Riley et al., 1993).

Estas investigaciones junto con los estudios de inmunización en animales demuestran que MSP-1 se trata de un candidato muy prometedor para el desarrollo de una vacuna contra la malaria.

En general estos estudios se pueden diferenciar en dos planteamientos, o bien se usa material purificado de parásitos o material producido en sistemas heterólogos.

Tanto para investigaciones sobre la función como para el uso como vacuna, las proteína se deben producir con buen rendimiento, alta calidad y de forma reproducible. Si bien se puede purificar MSP-1 de parásitos, realmente esto solo es posible a pequeña escala con grandes gastos y por lo tanto la producción de MSP-1 según los criterios mencionados no es realizable de este modo.

Los virus vaccinia pertenecen al género Orthopoxvirus en la subfamilia de los Chordopoxvirinae. Se trata respecto a los virus de la viruela de virus complejos, que con un genoma de ADN bicatenario de aprox. 200 kb y un tamaño de 250 x 350 nm pertenecen a los mayores virus conocidos. Constan de un virión en forma de ortoedro que está rodeado de una envuelta de membrana. En la célula huésped tiene lugar la replicación y generación del virus de la viruela exclusivamente en el citoplasma (para una revisión: Moss et al., 1996). Los virus vaccinia tienen un espectro de células huésped muy amplio, infectan casi todas las células que provienen tanto de seres humanos como de animales. En 1953 Anton Mayr aisló y purificó la cepa de dermovaccinia del corioalantoides vaccinia Ankara (CVA). Este virus se multiplicó mediante el pase continuo en fibroblastos embrionarios de pollo y de ahí se produjo un virus atenuado, que ya no muestra virulencia en animales y seres humanos (Stickl et al., 1974). A pesar de ello se pudo seguir usando el virus para la inmunoprofilaxis contra las enfermedades ocasionadas por los Orthopoxvirus en seres humanos y animales (Stickl et al., 1974). Este virus se nombró virus vaccinia Ankara modificado (MVA) de acuerdo con su lugar de origen.

Examinado desde la genética molecular el virus ha perdido durante los más de 570 pases en fibroblastos embrionarios de pollo 31 kb de la secuencia de ADN de su genoma, principalmente en forma de seis grandes deleciones, entre ellas al menos dos genes, que determinan el espectro de células huésped y por lo tanto la capacidad de replicación del virus (Meyer et al., 1991). La construcción de partículas víricas infecciosas en una infección por MVA en la mayoría de las células procedentes de mamíferos, incluidas las células de seres humanos, se bloquea primeramente muy tarde en el ciclo infeccioso, en el paso de ensamblaje de los viriones, es decir, los genes víricos bajo el control de promotores tanto...

1. Vacuna que comprende

en donde el fragmento de MSP-1 o los fragmentos de MSP-1 codificado(s) por el ácido nucleico se elige(n) exclusivamente de:

2. Vacuna según la reivindicación 1, caracterizada en que la proteína MSP-1 es la proteína MSP-1 del aislado 3D7 o la proteína MSP-1 de la cepa FCB1.

3. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada en que el ácido nucleico que codifica MSP-1 tiene un contenido en AT reducido comparado con la secuencia salvaje.

4. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada en que el ácido nucleico está bajo el control de un promotor.

5. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada en que el ácido nucleico está fusionado en el extremo 5' con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de un péptido señal.

6. Vacuna según la reivindicación 5, caracterizada en que la secuencia del péptido señal dirige la secreción del producto génico.

7. Vacuna según la reivindicación 5, caracterizada en que la secuencia del péptido señal dirige la localización estable a la membrana del producto génico.

8. Vacuna según la reivindicación 5, caracterizada en que la secuencia señal dirige el anclaje por GPI del producto génico.

9. Vacuna según la reivindicación 8, caracterizada en que la vacuna contiene además como componente c) MSP-1 y/o un fragmento de la misma especificado en la reivindicación 1 o una combinación de fragmentos de la misma especificados en la reivindicación 1.

10. Vacuna según la reivindicación 9, caracterizada en que los componentes a) y c) se pueden administrar de forma simultánea, secuencial o por separado.

11. Uso de la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la producción de un medicamento para la profilaxis o terapia de la malaria.

12. Uso de la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y de MSP-1 y/o un fragmento de la misma especificado en la reivindicación 1 o una combinación de fragmentos de la misma especificados en la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para la profilaxis o terapia de la malaria.