Procedimiento para la producción de ácido hialurónico, en el que (1) una célula de espermatofita,

pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presentan una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, (2) se cultiva un transformado obtenido por dicha transformación, y (3) se separa el ácido hialurónico producido por dicho transformado

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere principalmente a un procedimiento de producción de ácido hialurónico (o hialuronano o hialuronato; AH) por las células transformadas de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen o espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados con capacidad de producir ácido hialurónico, y a los 5 procedimientos de dichas células transformadas de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen o de dichos espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Una planta es un sistema ideal para la producción de hidratos de carbono con baja carga de energía, en la que los carbohidratos son producidos por fotosíntesis a partir de agua y dióxido de carbono. A excepción 10 de una parte de los organismos, los demás organismos no pueden sintetizar hidratos de carbono por sí mismos ni utilizar los azúcares procedentes de las plantas. Mientras tanto, cada animal y cada microorganismo intrínsecamente tiene capacidad de sintetizar hidratos de carbono modificando los azúcares y extendiendo las cadenas de azúcar utilizando como fuentes los azúcares procedentes de las plantas, y existen derivados de azúcares e hidratos de carbono procedentes de animales y microorganismos, que no pueden producir las 15 plantas. Los hidratos de carbono que no se pueden producir en las plantas y son producidos por animales y microorganismos incluye el ácido hialurónico.

El ácido hialurónico es un glucosaminoglucano (mucopolisacárido) aislado del cuerpo del humor vítreo del globo ocular de la especie bovina por Meyer y Palmer en 1934 (Meyer, K. y Palmer, J.W. (1934) J. Biol. Chem., 107, 629-634). Ellos han demostrado que esta sustancia es un polisacárido lineal de unidades 20 repetidas de disacárido ácido β-1,3-N-acetilglucosamina β-1,4 glucurónico, (Weissman, B. y Meyer, K. (1954) J. Am. Chem. Soc., 76, 1753-57).

Posteriormente, en las décadas de 1950 y 1960, el estudio sobre la biosíntesis del ácido hialurónico se realizó mediante un sistema exento de células del grupo A de Streptococcus. La actividad enzimática de los estreptococos localizada en la fracción de la membrana se demostró utilizando nucleótidos con dos azúcares 25 de ácido uridina-5'-difosfoglucurónico (a veces denominado ácido UDP-glucurónico o UDP-GlcA) y uridina-5'-difosfo-N-acetilglucosamina (a veces denominada UDP-N-acetilglucosamina o UDP-GlcNAc) en la producción de una cadena de ácido hialurónico (Markovitz, M., Cifonelli, J.A. y Dorfman, A. (1959) J. Biol. Chem., 234, 2343-2350). Ha sido difícil desde hace mucho tiempo solubilizar y purificar en gran medida la ácido hialurónico sintasa en forma activa estable, pero un gen (hasA) que codifica la ácido hialurónico sintasa estreptocócica se 30 clonó en 1993 (DeAngelis, P. L., Papaconstantinou, J. y Weigel, P.H. (1993) J. Biol. Chem., 268, 14568-14571). Desde entonces, se publicaron clonaciones de los genes que codifican la ácido hialurónico sintasa en células de mamífero (Itano, N. y Kimata, K. (1996) J. Biol. Chem., 271, 9875-9878.; Itano, N. y Kimata, K., (1996) Biochem. Biophys. Res;. Commun., 222, 816-820 Spicer, A. P., Augustine, M. L. y McDonald, J. A. (1996) J. Biol. Chem., 271, 23400-23406; Spicer, A. P., Olson, J. S. y McDonald J. A. (1997) J. Biol. Chem., 272, 8957-35 8961.; Shyjan A. M., Heldin, P., Butcher C. E., Yoshino T. y Briskin, M. J. (1996) J. Biol. Chem., 271, 23395-23399; Watanabe, K. y Yamaguchi, Y. (1996) J. Biol. Chem., 1., 271, 22945-22948), además se han descubierto los genes que codifican la ácido hialurónico sintasa en el virus PBCV chlorella (DeAngelis, P. L., Jing W., Graves, M. V., Burbank, D. E. y vam Etten, J. L. (1998) Science, 278, 1800-1804) y Passteurella multocida (DeAngelis, P. L., Jing W., Drake, R. R. y Achyuthan, A.M. (1998) J. Biol. Chem., 273, 8454-8458), y 40 se han obtenido las enzimas recombinantes de la forma activa.

Junto con el avance de estos estudios, se han dilucidado ampliamente las funciones fisiológicas del ácido hialurónico, y se han demostrado las propiedades físico-químicas exclusivas y las funciones biológicas del mismo. El ácido hialurónico de alto peso molecular se ha utilizado para el tratamiento de la artrosis deformante, una ayuda de la cirugía para la oftalmología, para la prevención de la adherencia y la aceleración 45 de la cicatrización de heridas. También se ha publicado que el ácido hialurónico de bajo peso molecular tiene efectos fisiológicamente activos, y ha sido previsto su aplicación a los biomateriales y las nuevas utilizaciones médicas.

Hasta ahora, el ácido hialurónico se ha producido por extracción de tejidos de mamíferos o fermentación microbiana. Sin embargo, el riesgo de contaminación, por ejemplo, con las encefalopatías 50 espongiformes transmisibles (priones) o la transmisión de virus a los seres humanos ha preocupado en la extracción de los tejidos de mamíferos. Para las células de mamíferos, su mantenimiento es difícil y requiere medios costosos, y, además, una tasa de crecimiento del mismo es lenta. Mientras tanto para la fermentación microbiana, los medios que contienen los azúcares y el costo de la inversión en equipo son problemáticos. En Escherichia coli , no se produce el tratamiento de una proteína, es probable que se formen cuerpos de 55 inclusión y una proteasa degrade un producto, que son problemáticos (Petrides, D. et al. (1995) Biotech.

Bioeng., 48, 529). Cuando la sustancia terapéutica se produce en el microorganismo, el costo de purificación se vuelve sumamente caro para impedir la contaminación con endotoxinas.

A partir de estos resultados, si se producen azúcares originales en las plantas mediante la fotosíntesis y el ácido hialurónico se puede producir en las plantas utilizando dichos azúcares, parece ser industrialmente ventajoso en términos de seguridad y coste. 5

Sin embargo, aunque hay ejemplos en los que las proteínas procedentes de las células de mamíferos o microorganismos se expresan en las plantas (Giddings, G. et al. (2000) Nat. Biotecnol., 18, 1151-1155; Daniell, H. et al. (2001) Trends Plant Sci., 6, 219-226), la configuración y estructura de la cadena de azúcar necesaria para mantener la función de la proteína son diferentes de las del organismo original, y por lo tanto, la proteína producida con frecuencia no ha tenido la función original. Por ejemplo, la eritropoyetina se expresó en 10 las células BY-2 del tabaco, pero no había actividad fisiológica in vivo (Matsumoto, S. et al. (1995) Plant Mol. Biol., 27, 1163-1172).

En la tecnología convencional, proteínas procedentes de las células de mamíferos o de microorganismos se han expresado en las plantas, y las propias proteínas se han extraído y utilizado principalmente. Se ha publicado poco que las proteínas procedentes de las células de mamíferos o 15 microorganismos se han expresado en las plantas y que se produce una sustancia en la planta aprovechando la proteína expresada en la planta.

Como producción de sustancias en las plantas, se ha publicdo de que β-1,4-galactosiltransferasa humana se expresó en las células BY-2 del tabaco y, por consiguiente la galactosa estaba recién unida por el enlace β-1,4 a la cadena del azúcar de la glucoproteína convencionalmente presente (Palacpac, N. Q. et al. 20 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.. EE.UU., 96, 4692 a 4697). Sin embargo, esta reacción es la reacción en la que se transfiere un azúcar desde un nucleótido de azúcar utilizando la glucosiltransferasa, y es muy diferente de la reacción en la que una macromolécula, tal como el ácido hialurónico se genera transfiriendo dos tipos de azúcar de los tipos de nucleótidos de azúcar varias miles de veces.

La ácido hialurónico sintasa tiene generalmente muchos dominios transmembranarios o asociados a la 25 membrana. Cuando el gen extraño se expresa en el hospedador, en la proteína unida a la membrana tal como la ácido hialurónico sintasa, los dominios trans o asociados a la membrana a menudo no pueden mantener la estructura correcta. Por ejemplo, se ha sugerido que en la ácido hialurónico sintasa activa, una proteína ácido hialurónico sintasa y alrededor de 14 a 18 moléculas de cardiolipina que es uno de los fosfolípidos corrientes presentes en la membrana forman un complejo que afecta a la actividad de la ácido hialurónico sintasa 30 (Tlapak-Simmons, V. L. (1999) J. Biol. Chem., 274, 4239-4245). De esta manera, se prevé que es considerablemente difícil expresar en la planta la ácido hialurónico sintasa que la planta no tiene de forma...

1. Procedimiento para la producción de ácido hialurónico, en el que (1) una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presentan una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido 5 hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, (2) se cultiva un transformado obtenido por dicha transformación, y (3) se separa el ácido hialurónico producido por dicho transformado.

2. Procedimiento para la producción de ácido hialurónico, en el que (1) una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, 10 sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácido en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, (2) se cultiva un transformado obtenido por dicha transformación, y (3) se separa el ácido hialurónico producido por dicho transformado.

3. Procedimiento para la preparación de una célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen que presenta capacidad de producción de ácido hialurónico, en el que una célula de espermatofita, 15 pteridofita, briofita o liquen, se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico.

4. Procedimiento para la preparación de una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados 20 que presentan capacidad de producción de ácido hialurónico, en el que una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica una polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico. 25

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o un microorganismo.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la ácido hialurónico sintasa es del virus de chlorella.

7. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen que presenta capacidad de 30 producción de ácido hialurónico, obtenida mediante la transformación de una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica una polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico. 35

8. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados que presentan capacidad de producción de ácido hialurónico o una descendencia de los mismos, o un órgano de los mismos o un tejido de los mismos, obtenidos mediante la transformación de una/un espermatofita, pteridofita, briofita o liquen con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en 40 una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis de ácido hialurónico, en los que dichos descendencia, órgano o tejido comprenden el ADN mencionado en (i) o (ii).

9. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el órgano de los mismos o el tejido de los mismos según la reivindicación 8, en los que el órgano es uno o dos o más órganos seleccionados de entre una raíz, un tallo, un rizoma, una hoja, una flor, una semilla y un ápice del 45 brote.

10. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el órgano de los mismos o el tejido de los mismos según la reivindicación 8, en el que el tejido es uno o dos o más tejidos seleccionados de entre el grupo constituido por una epidermis, el floema, un parénquima, un xilema y un haz vascular. 50

11. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen que produce ácido hialurónico sintasa, obtenida mediante la transformación de una célula vegetal con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico. 55

12. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados que producen ácido hialurónico sintasa o una descendencia de los mismos, o un órgano de los mismos o un tejido de los mismos, obtenidos mediante la transformación de una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o ( ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de 5 aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, en los que dichos descendencia, órgano o tejido comprenden el ADN mencionado en (i) o (ii).

13. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen según la reivindicación 7 u 11, en la que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o un microorganismo.

14. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el 10 órgano de los mismos o el tejido de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en los que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o de un microorganismo.

15. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen según la reivindicación 7 u 11, en la que la ácido hialurónico sintasa es del virus de chlorella.

16. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el 15 órgano de los mismos o el tejido de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en los que la ácido hialurónico sintasa es del virus de chlorella.