PÉPTIDOS CITOTÓXICOS MODIFICADOS POR RESTOS VOLUMINOSOS O LIPOFÍLICOS.

Péptido modificado de 7 a 15 restos con tres o más restos catiónicos que es capaz de formar una hélice α

anfipática y en el que la citotoxicidad se ha mejorado mediante la introducción de uno o más aminoácidos lipófilos y voluminosos no genéticos, en el que el grupo R de dicho aminoácido lipófilo y voluminoso no genético no es estándar, tiene al menos 9 átomos que no son de hidrógeno y tiene dos anillos cerrados de 5 o 6 átomos, así como ésteres, amidas, sales y derivados cíclicos del mismo para uso en el tratamiento de una infección bacteriana o un tumor en un paciente

La presente invención se refiere a péptidos bioactivos, más particularmente a péptidos que se han modificado para mejorar su actividad citotóxica.

Una gran variedad de organismos utilizan los péptidos como parte del mecanismo de defensa del hospedador, con los que en los vertebrados se complementa al sistema inmunitario mediado por las células, que es muy específico [Mor, A., Hani, K. y Nicolas, P (1994) J. Biol. Chem, 269, 31635-31641. Boman, H. G. (1996) Scand. J. Immunol. 43, 475-482]. Se han aislado péptidos antimicrobianos de especies tan distintas como las bacterias y los mamíferos [Lehrer, R. I., Lichtenstein, A. K. y Ganz, T. (1993) Ann. Rev. Immunol. 11, 105-128]. Generalmente, estos péptidos antibióticos tienen una carga positiva neta y son propensión a formar estructuras de hélice α u hoja β anfipáticas cuando interaccionan con la bicapa fosfolipídica externa de la membrana celular bacteriana [Besalle, R., Gorea, A., Shalit, J., Metger, J. W., Dass, C., Desiderio, D. M. y Fridkin, M. (1993), J. Med. Chem. 36, 1203-1209]. En la mayoría de los casos se conocen los mecanismos moleculares detallados de la acción antibiótica, aunque algunos péptidos clasificados como péptidos de clase L (lítica) se cree que interaccionan con las membranas celulares bacterianas, formando probablemente canales iónicos o poros [Ludtke, S. J. , He, K., Heller, W. T., Harroun, T. A, Yang, L y Huang, H. W (1996) Biochemistry 35, 13723-13728], lo que conlleva cambios de permeabilidad y la resultante lisis celular.

Las magaininas son péptidos antibacterianos de la piel de la rana Xenopus laevis y se clasifican como antibióticos de clase L porque lisan específicamente las bacterias; otros péptidos tales como los mastroparanos, un veneno de abeja, carecen de esta especificidad porque lisan las células eucariotas así como las células procariotas, y se llaman venenos de clase L [Tytler, E. M., Anantharamiah, G. M., Walker, D. E., Mishra, V. K., Palgunachari, M. N. y Segrest, J. P (1995) Biochemistry, 34, 4393-4401]. La resistencia a los antibióticos mostrada por determinados microorganismos infecciosos es un problema creciente y siempre se necesitan nuevos antibióticos. Se conocen péptidos antibacterianos, tales como los péptidos de clase L, y se están descubriendo más con el objetivo de encontrar un péptido que sea muy citotóxico y preferentemente específico de las células procariotas. Existen diferencias en la estructura y la composición de las bicapas lipídicas entre los eucariotas y los procariotas, y entre los propios procariotas, lo que significa que diferentes péptidos tendrán especificidades muy diferentes.

Al igual que las magaininas y los mastroparanos, se han aislado péptidos de defensa de hospedadores en las polillas y moscas (cecropinas) y en el cangrejo herradura. Está clara la acción directa de estos péptidos de defensa del hospedador para repeler a los predadores, por ejemplo como venenos. La búsqueda de péptidos que muestran efectos antibióticos ha conducido a la identificación de otras proteínas/péptidos que no se esperaría que tuvieran propiedades citotóxicas. Uno de éstos es la lactoferrina, un transportador de hierro que también muestra un efecto antibacteriano débil.

Al igual que se han buscado nuevos péptidos antimicrobianos, más recientemente se ha explorado la mejora de la actividad de las proteínas o péptidos con propiedades antimicrobianas conocidas. En el caso de la lactoferrina bovina se ha digerido la proteína nativa con pepsina gástrica para producir un péptido, la lactoferricina B (LFB), que es mucho más activo que la lactoferrina bovina nativa. La LFB es un péptido de 25 restos que corresponde a los restos 17 a 41 de la lactoferrina bovina [Bellamy et al, (1992) Biochem. Biophys. Acta. 1121, pág. 130 y siguientes]. Se han llevado a cabo estudios de actividad según la estructura en las magaininas y se ha demostrado, por ejemplo, que la mejora de la helicidad y de la carga catiónica conduce a una mayor actividad antibacteriana [Chen, Y. H., Brown, J. H., Morell, J. L. y Huang, C. M. (1988) FEBS Letters 236, 462-466]. No obstante, tales modificaciones de secuencias a menudo dan lugar a una mayor actividad hemolítica. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención preparar péptidos y/o derivados peptídicos que tengan una actividad antibacteriana significativa, pero que preferentemente tengan una toxicidad baja, a saber, poco efecto sobre las células eucariotas normales, por ejemplo, una actividad hemolítica baja. Aunque que los eritrocitos no se pueden considerar células eucariotas típicas, proporcionan una manera cómoda de ensayar toxicidad y son un tipo de célula que los péptidos bioactivos terapéuticos no deben lisar en ningún caso en una cantidad significativa.

Se ha encontrado que aumentando la voluminosidad o la naturaleza lipófila de un péptido, su bioactividad puede aumentar, en particular su citotoxicidad. Preferentemente se aumenta la voluminosidad y la lipofilia de uno o más restos de aminoácidos.

Por lo tanto, según la presente invención se da a conocer un péptido de 7 a 15 restos con tres o más restos catiónicos que es capaz de formar una hélice α anfipática y en el que se ha mejorado la citotoxicidad por la introducción de uno o más aminoácidos lipófilos voluminosos no genéticos, en el que el grupo R de dicho aminoácido lipófilo y voluminoso no genético no es estándar, tiene al menos 9 átomos que no son de hidrógeno y tiene 2 anillos cerrados de 5 o 6 átomos, así como ésteres, amidas, sales y derivados cíclicos de los mismos, para uso en el tratamiento de una infección bacteriana o de un tumor en un paciente. Los aminoácidos estándares del código genético se pueden agrupar según sus características, particularmente la polaridad o la carga. Los agrupamientos adecuados son glicina y alanina, serina, treonina, asparragina, glutamina y cisteína, lisina, arginina e histidina, ácido aspártico y ácido glutámico y valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y tirosina. De los 20 aminoácidos estándares (genéticos), valina, leucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptófano y fenilalanina se pretende que estén cubiertos por la terminología «voluminoso y/o lipófilo», siendo preferentes los aminoácidos isoleucina, triptófano y fenilalanina. A lo largo de esta especificación, se han utilizado los código de tres letras y de una letra ampliamente utilizados y comprensibles para los 20 aminoácidos estándares. Al reemplazo de un aminoácido de un grupo con otro aminoácido en el mismo grupo se hace referencia convenientemente como una «sustitución conservativa». Tales sustituciones no afectan por lo general de forma material a las propiedades de los péptidos de la invención y allí donde cualquier péptido difiere de otro sólo por tales sustituciones, si un péptido es un péptido de acuerdo con la presente invención, entonces típicamente el otro péptido también será un péptido de acuerdo con la invención.

**(Ver fórmula)**

Los péptidos que incorporan un aminoácido lipófilo y voluminoso no genético mostrarán preferentemente una mejora del efecto citotóxico contra las células bacterianas o de tumores al mismo tiempo que la toxicidad de los péptidos, por ejemplo, su actividad hemolítica, se reduce o aumenta sólo moderadamente en comparación con el péptido natural u original.

Ha resultado sorprendente encontrar que los aminoácidos o sus derivados de un determinado tamaño se pueden utilizar para dar a conocer péptidos modificados que son particularmente adecuados para su utilización como péptidos citotóxicos. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, «aminoácido lipófilo y voluminoso no genético» quiere significar cualquier aminoácido o derivado de aminoácido que aparece de forma natural, pero no uno de los 20 aminoácidos estándares del código genético, cuyo grupo R (cadena lateral α) preferentemente no tiene carga y tiene al menos 9 átomos que no son de hidrógeno. Los aminoácidos voluminosos y lipófilos no genéticos particularmente preferentes tendrán al menos 12, preferentemente al menos 18, átomos que no son de hidrógeno en el grupo R. La terminología «que no son de hidrógeno» se utiliza para indicar que los átomos de hidrógeno no están incluidos cuando se cuenta el número de átomos presentes en un grupo o molécula.

Preferentemente, el grupo R del aminoácido lipófilo y voluminoso no genético tendrá al menos 9 átomos que no son de hidrógeno, por ejemplo, átomos de carbono, y debe tener al menos 2 anillos cerrados de 5 o 6 átomos, y convenientemente, estos dos anillos están... [Seguir leyendo]

1. Péptido modificado de 7 a 15 restos con tres o más restos catiónicos que es capaz de formar una hélice α anfipática y en el que la citotoxicidad se ha mejorado mediante la introducción de uno o más aminoácidos lipófilos y voluminosos no genéticos, en el que el grupo R de dicho aminoácido lipófilo y voluminoso no genético no es estándar, tiene al menos 9 átomos que no son de hidrógeno y tiene dos anillos cerrados de 5 o 6 átomos, así como ésteres, amidas, sales y derivados cíclicos del mismo para uso en el tratamiento de una infección bacteriana o un tumor en un paciente.

2. Péptido para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aminoácido lipófilo y voluminoso no genético es un resto de fenilalanina o triptófano modificado.

3. Péptido para uso según la reivindicación 2, en el que el resto modificado es triptófano que tiene sustitución en la posición 1 o 2 del anillo indol.

4. Péptido para uso según la reivindicación 1, en el que el aminoácido lipófilo y voluminoso no genético se selecciona entre el grupo que consiste en 3-benzotienilalanina, 4-4'-bifenilalanina, 3,3-difenilalanina, 1-naftilalanina, 2naftilalanina, benciltirosina, ciclohexiltirosina, 7-benzioxitriptófano, 3-antracenil-L-alanina, 3-(2-quinoil)alanina, pbenzoilfenilalanina, tiroxina y 3,3',5-triyodo-L-tironina.

5. Péptido para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que también comprende uno o más Daminoácidos.

6. Utilización de un péptido según está definido en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una infección bacteriana o un tumor en un paciente.