Un procedimiento para aislar un compuesto que muestra actividad de translocación en membrana a partir de una genoteca de exhibición de péptidos,

comprendiendo dicha genoteca una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos exhibidos, y que comprende las etapas de: a) Expresión de una pluralidad de construcciones de ácido nucleico, en la que cada construcción de ácido nucleico comprende una secuencia promotora enlazada en forma operativa a la secuencia de ácido nucleico, resultando dicha expresión de la pluralidad de de construcciones de ácido nucleico en la formación de una pluralidad de complejos de péptido de ácido nucleico, comprendiendo cada complejo al menos un péptido exhibido asociado con la correspondiente construcción de ácido nucleico que codifica el péptido exhibido; b) Exposición de la pluralidad de complejos de péptido de ácido nucleico a una población de compartimentos encapsulados en membrana, y permisión de que tenga lugar una reacción de translocación; c) Eliminación de cualesquiera complejos de péptido de ácido nucleico que permanecen sin asociar con los compartimentos encapsulados en membrana; y d) Recuperación de cualesquiera complejos de péptido de ácido nucleico internalizado del interior de los compartimentos encapsulados en membrana, y caracterización del péptido codificado por la secuencia de ácido nucleico como comprensivo de un péptido apto para translocación en membrana (PTM), en el que la genoteca de expresión de péptidos es una genoteca de expresión de péptidos in vitro

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se relaciona con métodos para el aislamiento de compuestos novedosos denominados péptidos aptos para translocación en una membrana (PTMs). Tales PTMs se caracterizan por la capacidad para transportar tanto a sí mismos como a grupos no aptos para translocación asociados con las membranas a lo largo de los PTM.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La capacidad de comunicación de ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, amino ácidos, pequeñas moléculas, virus, etc. (de aquí en adelante referidos colectivamente como “grupos no aptos para translocación”) al interior de células o tipos celulares específicos es útil para diversas aplicaciones en oncología, biología del desarrollo, terapia génica y en la comprensión general del modo de operación de proteínas concretas, ácidos nucleicos y pequeñas moléculas en un sistema tipo. La mayoría de las proteínas y péptidos terapéuticamente importantes no se trastocan fácilmente a lo largo de membranas biológicas. Sin embargo, algunos factores de transactivación y homeoproteínas han mostrado ser aptos de facilitar la translocación en membranas, incluyendo los péptidos derivados de Tat (Fawell et al., 1994, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 91:664-668), la tercera hélice de la proteína con homeodominio antennapedia (Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:10444-10450; Patentes estadounidenses números 5.888.762 y 6.015.787), y VP22 (Schwarze et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci. 21:45-48). Tales péptidos derivados naturalmente están a menudo aislados en vesículas de membranas dentro del citoplasma de la célula, que, a menudo, impide que el grupo no apto para translocación asociado acceda a su objetivo deseado (Potocky et al., 2003, J. Biol. Chem.

278: 50188-94).

Se ha informado previamente de la existencia de una serie de grupos aptos para traslocación en una membrana (por ejemplo, péptidos). Por ejemplo, la patente mundial WO 01/27154 describe un péptido específico apto para traslocación en una membrana en toda su longitud (PTML), que es apto de incrementar el movimiento de un agente activo o de una partícula activa a lo largo de la membrana de un lípido, tal como en el interior de una célula, dentro o fuera de un compartimiento intracelular y a lo largo de una capa celular.

La patente mundial WO 99/49879 describe una secuencia de péptido artificial apto para translocación en una membrana (SPTM), que se usa para facilitar la entrada de poli péptidos, dominios de proteínas, o proteínas en toda su extensión a través de una membrana celular. Se discuten también los métodos de uso de esta secuencia para proteínas obra de ingeniería genética con permeabilidad de membrana celular.

La patente estadounidense 2004/197867 describe poli péptidos de fusión que comprenden dominios de transducción de proteínas y poli péptidos osteoinductivos, que pueden ser usados para inducir la osteogénesis y para promover la síntesis de proteoglicanos. También se describen vectores de expresión que pueden ser usados para expresar los poli péptidos de fusión, y métodos de uso de los poli péptidos para inducir formación ósea.

PERSSON et al. (2003) Biochemistry, 42 (2): 421-429, describe un análisis utilizado para medir el enlace de péptido apto para translocación en una membrana, penetrando liposomas con carga negativa.

La patente mundial WO 02/088318 describe un complejo lipídico para la liberación de moléculas de ácido nucleico biológicamente activas a células in Vitro, ex vivo o in vivo. Para promover la liberación de la molécula de ácido nucleico activo, el complejo lipídico puede incluir un factor de orientación a la célula, tal como un péptido sintético apto para translocación en una membrana (PTM). También se indican las secuencias de péptido específico apto para translocación en una membrana.

La patente mundial WO 2004/050871 describe dos proteínas de fusión que contienen una proteína o un fragmento de proteína, un dominio de interacción, y una secuencia de translocación proteínica, que provoca que las proteínas de fusión sean translocadas por la membrana citoplásmica cuando se expresen en una bacteria.

La patente mundial WO 00/58488 describe métodos para la modulación de procesos celulares por contacto de una célula con una molécula de modificación de proceso celular adosada a un poli péptido de translocación. Un gen específico puede ser transferido por adosado de un poli nucleótido en particular (que contiene el gen específico) a un poli péptido de translocación. Alternativamente, puede ser transferido un agente regulatorio para un gen específico en particular por adosado del agente regulador a un poli péptido de translocación.

La patente mundial WO 2004/081188 describe composiciones para transportar a lo largo de una membrana biológica que comprenda un péptido LMWP de traslocación en membrana y una molécula de carga. El péptido LMWP puede ser unido, adosado, fusionado o asociado de otra forma con la molécula de carga. También se divulgan algunos péptidos LMWP específicos, tales como los de péptidos de protamina digerida en termo lisina purificada.

La patente mundial WO 2005/017188 describe proteínas de fusión que incluyen un péptido apto para translocación en una membrana y una proteína IKB inhibitoria que pueden ser usados para inhibir la cascada NF-KB en el interior de una célula. La secuencia del péptido apto para translocación en una membrana comprende al menos ocho residuos consecutivos de una secuencia específica de péptido.

TSENG et al. (2002), Molecular Pharmacology, 62 (4): 864-872, hace referencia a la translocación de liposomas en células cancerígenas por péptidos que penetran en células, penetratina y TAT; y describe un estudio cinético y de eficacia de los mismos.

TORCHILIN et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(15): 8786-8791, describe liposomas que tienen el péptido TAT en la superficie para su uso en la liberación molecular.

Sin embargo, ninguno de los documentos supra describe o sugiere cómo los péptidos aptos para translocación en una membrana pueden ser seleccionados. Hasta la fecha, los péptidos novedosos habían sido conseguidos a través del uso de dos planteamientos diferentes. El primer enfoque produce aspirantes a péptidos por la síntesis química de una genoteca elegida al azar de 610 péptidos aminoácidos (J. Eichler et al, 1995, Med. Res. Rev., 15:481-496; K. Lam, 1996, Anticancer Drug Des., 12: 145-167; M. Lebl et al, 1997, Methods Enzymol. 289:336-392). En el segundo planteamiento, los aspirantes a péptidos son sintetizados por clonación de una genoteca de nucleótidos elegida al azar dentro de un gen fagocítico filamentoso Ff, que permite que péptidos de un tamaño mucho mayor se manifiesten en la superficie del bacteriófago (H. Lowman, 1997, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:401-424; G. Smith et al., 1993, Meth. Enz. 217:228-257). Se han hecho también genotecas de péptidos elegidos al azar de hasta 38 amino ácidos de longitud, y es probable conseguir péptidos más largos usando este sistema. Las bibliotecas de péptidos que se producen usando cualquiera de estas estrategias se mezclan generalmente con una proteína específica preseleccionada ligada a la matriz. Se eluyen los péptidos vinculadores, y sus secuencias son especificadas. Se sintetizan nuevos péptidos a partir de esta información y sus propiedades biológicas se especifican. El despliegue fagocítico se ha usado previamente para identificar péptidos que se trastocan, pero son relativamente pocos los péptidos que han sido aislados por este método, y los que lo han sido son generalmente de un tipo celular específico y requieren endocitosis para la entrada en una célula (Gao et al., 2002, Bioorg. Med Chem., 10: 4057-65). Una desventaja asociada con los péptidos del estado de la técnica previo que dependen de la endocitosis para cruzar la membrana celular es que, generalmente, tal mecanismo resulta en la entrega del péptido que se transloca, y cualquier grupo no translocador asociado, a endosomas donde ambos son destruidos sin causar el efecto celular deseado.

Una desventaja ulterior del estado de la técnica es que el tamaño de las genotecas que pueden ser generadas tanto con expresión fagocítica como con síntesis química se limita al intervalo comprendido entre 106-109. Esta limitación ha resultado en el aislamiento de péptidos de afinidad relativamente baja, a menos se use subsiguientemente un proceso de maduración que exige tiempo. Esta limitación en el... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para aislar un compuesto que muestra actividad de translocación en membrana a partir de una genoteca de exhibición de péptidos, comprendiendo dicha genoteca una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos exhibidos, y que comprende las etapas de:

a) Expresión de una pluralidad de construcciones de ácido nucleico,

en la que cada construcción de ácido nucleico comprende una secuencia promotora enlazada en forma operativa a la secuencia de ácido nucleico, resultando dicha expresión de la pluralidad de de construcciones de ácido nucleico en la formación de una pluralidad de complejos de péptido de ácido nucleico, comprendiendo cada complejo al menos un péptido exhibido asociado con la correspondiente construcción de ácido nucleico que codifica el péptido exhibido;

b) Exposición de la pluralidad de complejos de péptido de ácido nucleico a una población de compartimentos encapsulados en membrana, y permisión de que tenga lugar una reacción de translocación;

c) Eliminación de cualesquiera complejos de péptido de ácido nucleico que permanecen sin asociar con los compartimentos encapsulados en membrana; y

d) Recuperación de cualesquiera complejos de péptido de ácido nucleico internalizado del interior de los compartimentos encapsulados en membrana, y caracterización del péptido codificado por la secuencia de ácido nucleico como comprensivo de un péptido apto para translocación en membrana (PTM),

en el que la genoteca de expresión de péptidos es una genoteca de expresión de péptidos in vitro.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la población de compartimentos encapsulados en membrana es una población de uno o más tipos celulares.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, donde el uno o más tipos celulares comprenden una capa de células.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, donde la etapa (d) se modifica para recuperar complejos de péptido de ácido nucleico que se trastocan por la capa de células.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 ó la reivindicación 4, en el que las células son células Caco-2.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la población de compartimentos encapsulados en membrana es una población de liposomas.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, comprendiendo ulteriormente una etapa posterior a la (c) de eliminar complejos de péptido de ácido nucleico enlazados a la superficie de los compartimentos encapsulados en membrana, pero que no han sido internalizados.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la eliminación comprende la exposición de los compartimentos encapsulados en membrana a una proteasa, a una nucleasa o a una combinación de una proteasa y una nucleasa.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en los complejos de ácido nucleico de péptido asociado no en membrana están separados de los compartimentos encapsulados en membrana por la centrifugación de los compartimentos por medio de una capa no acuosa.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la capa no acuosa es aceite mineral.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la genoteca de exhibición de péptido in vitro es una genoteca de expresión de péptido in vitro CIS.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, comprendiendo ulteriormente la fase de correlación del uno o más péptidos expresos aptos para translocación en membrana de la etapa (d) con las correspondientes construcciones de ácido nucleico, identificando en consecuencia secuencias de ácido nucleico para los compuestos de péptidos aptos para translocación en membrana.

13. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el PTM comprende una secuencia de amino ácido de:

(i) entre 2 y 50 residuos de longitud;

(ii) entre 2 y 25 residuos de longitud; o

(iii) entre 2 y 20 residuos de longitud.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo ulteriormente el aislamiento de un PTM.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, comprendiendo ulteriormente la formación de un derivado del PTM por la implementación de un experimento de maduración para mejorar una o más características del PTM.

16. El procedimiento de la reivindicación 14 ó de la reivindicación 15, comprendiendo ulteriormente la conjugación del PTM a un grupo no apto para translocación.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el grupo no apto para translocación conjugado es una molécula terapéutica.

18. El procedimiento de la reivindicación 16 ó de la reivindicación 17, en el que la conjugación se hace por medio de un enlace di – sulfuro o un enlace de péptido adherible en forma enzimática.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la molécula terapéutica es una molécula si ARN, un ácido nucleico de péptido o un anticuerpo de fragmento de anticuerpo.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, comprendiendo ulteriormente la mezcla del PTM con una población de liposomas para formar una concentración de liposomas que comprende uno o más liposomas y uno o más PTM; incluyendo ulteriormente, de forma opcional, un dominio de anticuerpo.

21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, comprendiendo ulteriormente la formulación de una composición farmacéutica que comprende el PTM.

22. El procedimiento de la reivindicación 12, comprendiendo ulteriormente el aislamiento de la construcción de ácido nucleico y su inserción en un vector o construcción de expresión.