PÉPTIDOS ANTIANGIOGÉNICOS POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS Y PROCEDIMIENTO PARA INHIBIR ANGIOGÉNESIS.

Péptidos antiangiogénicos, polinucleótidos que codifican los mismos y procedimientos para inhibir angiogénesis Campo técnico La presente invención se refiere al campo de la química de los péptidos. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación y al uso de péptidos que contienen secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a secuencias correspondientes de la región en rosquilla 5 de plasminógeno de mamífero, a composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos, a anticuerpos específicos para el receptor de angiostatina, a medios para la detección y la medición de angiostatina, a agentes citotóxicos ligados a proteínas de angiostatina y al tratamiento de enfermedades que se producen a partir de o son exacerbadas por angiogénesis. Antecedentes de la invención ES 2 367 307 T3 La angiogénesis, el procedimiento por el que se forman nuevos vasos sanguíneos, es esencial para las actividades normales del cuerpo que incluyen reproducción, desarrollo y reparación de heridas. Aunque el procedimiento no se entiende completamente, se cree que implica una compleja interacción de moléculas que regulan el crecimiento de células endoteliales (las células primarias de vasos sanguíneos capilares). Bajo condiciones normales, estas moléculas parecen mantener la microvasculatura en un estado quiescente (es decir, uno sin crecimiento de capilares) durante periodos prolongados que pueden durar durante semanas o, en algunos casos, décadas. Cuando sea necesario (tal como durante la reparación de heridas), estas mismas células pueden someterse a la rápida proliferación y reposición en el transcurso de un periodo de 5 días (Folkman, J. y Shing, Y., The Journal of Biological Chemistry, 267(16), 10931-10934, y Folkman, J. y Klagsbrun, M., Science, 235, 442-447 (1987). Aunque la angiogénesis es un proceso altamente regulado bajo condiciones normales, muchas enfermedades (caracterizadas como enfermedades angiogénicas) son accionadas por angiogénesis sin regular persistente. Establecido de otro modo, la angiogénesis sin regular puede tanto producir una enfermedad particular directamente como exacerbar una afección patológica existente. Por ejemplo, la neovascularización ocular se ha implicado como la causa más común de ceguera y domina aproximadamente 20 enfermedades del ojo. En ciertas afecciones existentes, tales como artritis, los vasos sanguíneos capilares recientemente formados invaden las articulaciones y destruyen el cartílago. En diabetes, los nuevos capilares formados en la retina invaden el vítreo, sangran y producen ceguera. El crecimiento y la metástasis de tumores sólidos también depende de la angiogénesis (Folkman, J., Cancer Research, 46, 467-473 (1986), Folkman, J., Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6 (1989). Se ha mostrado, por ejemplo, que los tumores que se agrandan a más de 2 mm deben obtener su propio riego sanguíneo y lo hacen induciendo el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares. Una vez que estos nuevos vasos sanguíneos se incorporan en el tumor, proporcionan un medio para que las células tumorales entren en la circulación y metastaticen a sitios distantes tales como el hígado, pulmón o hueso (Weidner, N., y col., The New England Journal of Medicine, 324(1): 1-8 (1991)). Hasta la fecha se han descrito y caracterizado varios factores angiogénicos que se producen naturalmente (Fidler, J.I. y Ellis, L.M., Cell, 79: 185-189 (1994)). Recientemente, O'Reilly y col. han aislado y purificado una proteína de 38 kilodalton (kDa) de suero y orina de ratones que tienen un tumor que inhibe la proliferación de células endoteliales (O'Reilly, M. y col., Cell, 79: 315-328 (1994) y la solicitud internacional WO 95/29242 publicada el 2 de noviembre de 1995). El análisis de microsecuencias de este inhibidor endotelial mostró el 98% de homología de secuencias con un fragmento interno de plasminógeno murino. La angiostatina, como se llamó al fragmento inhibidor murino, era un péptido que incluyó las cuatro primeras regiones en rosquilla de plasminógeno murino. Un fragmento de péptido de la misma región de plasminógeno humano (es decir, que contiene las rosquillas 1-4) también inhibió fuertemente la proliferación de células endoteliales capilares in vitro e in vivo. El plasminógeno intacto del que se derivó este fragmento de péptido no tuvo un efecto inhibidor tan potente. Varios inhibidores de angiogénesis están actualmente en desarrollo para su uso en el tratamiento de enfermedades angiogénicas (Gasparini, G. y Harris, A. L., J. Clin. Oncol., 13(3): 765-782, (1995)), pero hay desventajas asociadas a estos compuestos. La suramina, por ejemplo, es un potente inhibidor de la angiogénesis, pero produce toxicidad sistémica grave en seres humanos a las dosis requeridas para la actividad antitumoral. Compuestos tales como retinoides, interferones y antiestrógenos son seguros para el uso humano, pero tienen efectos antiangiogénicos débiles. Todavía otros compuestos pueden ser difíciles o costosos de preparar. Por tanto, existe la necesidad de compuestos útiles en el tratamiento de enfermedades angiogénicas en mamíferos. Más específicamente, existe la necesidad de inhibidores de la angiogénesis que sean seguros para uso terapéutico y que presenten toxicidad selectiva con respecto a la afección patológica tal como inhibiendo selectivamente la proliferación de células endoteliales, a la vez que no muestran un grado de toxicidad o sólo un bajo grado de toxicidad para células normales (es decir, no cancerosas). Tales compuestos también se prepararían fácilmente y rentablemente. 2 Resumen de la invención La presente invención proporciona un compuesto del péptido de la rosquilla 5 representado por la fórmula estructural A-B1-C1-X1-Y (II) o una sal farmacéuticamente aceptable, éster o profármaco del mismo en la que A está ausente o es un grupo protector de nitrógeno; Y está ausente o es un grupo protector de ácido carboxílico; B1 está ausente o tiene de 1 a aproximadamente 176 residuos de aminoácidos que se producen naturalmente correspondientes a la secuencia de aproximadamente la posición de aminoácidos 334 a la posición de aminoácidos 513 de SEC ID Nº:1; C1 es la secuencia de la posición de aminoácidos 514 a la posición de aminoácidos 523 de SEC ID Nº:1; y X1 está ausente o tiene de 1 a aproximadamente 10 residuos de aminoácidos que se producen naturalmente correspondientes a la secuencia de la posición de aminoácidos 524 a la posición de aminoácidos 533 de SEC ID Nº:1 y homólogos de fórmula A-B1-C1-X1-Y que tienen al menos el 95% de identidad de aminoácidos con el fragmento B1-C1-X1 en la que los homólogos poseen actividad antiangiogénica. También se desvela un procedimiento para tratar un paciente en necesidad de terapia antiangiogénica que comprende administrar al paciente un compuesto que contiene el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o una proteína de fusión del mismo. La presente invención también incluye una composición para tratar un paciente en necesidad de terapia antiangiogénica que comprende un compuesto que contiene el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o proteína de fusión del mismo tanto solo como en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/u opcionalmente compuestos de liberación sostenida para formar una composición terapéutica. La presente invención también incluye una composición para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, artritis, degeneración macular y retinopatía diabética que comprende un compuesto que contiene el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o una proteína de fusión del mismo. La presente invención también incluye una composición que comprende una secuencia de polinucleótidos mono o bicatenaria aislada que codifica el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o proteína de fusión del mismo. Un polinucleótido tal es preferentemente una molécula de ADN. La presente invención también incluye un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o proteína de fusión del mismo, en el que el vector puede expresar el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o proteína de fusión del mismo cuando está presente en una célula y una composición que comprende una célula que contiene un vector en la que el vector contiene una secuencia de ADN que codifica el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o proteína de fusión del mismo. La presente invención engloba adicionalmente procedimientos de terapia génica por los cuales secuencias de ADN que codifican el fragmento del péptido de la rosquilla 5 o proteína de fusión del mismo o conjugado del fragmento del péptido de la rosquilla 5 se introducen en un paciente para modificar in vivo los niveles de la rosquilla 5. La presente invención... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que tiene la fórmula A-B1-C1-X1-Y o una sal farmacéuticamente aceptable o éster del mismo, en la que A está ausente o es un grupo protector de nitrógeno, Y está ausente o es un grupo protector de ácido carboxílico, B1 está ausente o tiene de 1 a 176 residuos de aminoácidos que se producen naturalmente correspondientes a la secuencia de la posición de aminoácidos 334 a la posición de aminoácidos 513 de SEC ID Nº 1, C1 es la secuencia de la posición de aminoácidos 514 a la posición de aminoácidos 523 de SEC ID Nº 1 y X1 está ausente o tiene de 1 a 10 residuos de aminoácidos que se producen naturalmente correspondientes a la secuencia de la posición de aminoácidos 524 a la posición de aminoácidos 533 de SEC ID Nº 1; y homólogos de fórmula A-B1-C1-X1-Y que tienen al menos el 95% de identidad de aminoácidos con el fragmento B1­ C1-X1 en el que los homólogos poseen actividad antiangiogénica. 2. El compuesto de la reivindicación 1 en el que B y X1 están ausentes y A, C1 e Y son como se definen aquí. 3. El compuesto de la reivindicación 2 en el que A es N-Ac e Y es -NH2. 4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define en las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 5. Un compuesto como se define en las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para tratar una enfermedad en un paciente en necesidad de terapia antiangiogénica. 6. El compuesto según la reivindicación 5 en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cáncer, artritis, degeneración macular y retinopatía diabética. 7. El compuesto según la reivindicación 6 en el que dicha enfermedad es cáncer. 8. Una composición que comprende una secuencia de polinucleótidos mono o bicatenaria aislada que codifica un compuesto según la reivindicación 1. 9. La composición de la reivindicación 8 en la que dicha secuencia de polinucleótidos es una secuencia de ADN. 10. Una célula adecuada para ser implantada en un animal humano o no humano, conteniendo dicha célula un vector en la que dicho vector contiene una secuencia de ADN que codifica un compuesto como se define en la reivindicación 1, en la que la célula no es un citoblasto embrionario humano. 11. Un procedimiento de preparación de un compuesto según la reivindicación 1 que comprende las etapas de: (a) exponer un plasminógeno de mamífero a elastasa a una relación de 1:100 a 1:3000 para formar una mezcla de dicho plasminógeno y dicha elastasa; (b) incubar dicha mezcla; (c) aislar dicho compuesto de dicha mezcla. 12. Un polinucleótido mono o bicatenario aislado que codifica un compuesto según la reivindicación 1. 13. El polinucleótido de la reivindicación 12 que es una molécula de ADN. 14. El polinucleótido de la reivindicación 12 que es una molécula de ARN. 15. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica un compuesto según la reivindicación 1. 16. El vector de la reivindicación 15 que es un vector de expresión. 17. El vector de la reivindicación 16 en el que el vector de expresión se construye incorporando un polinucleótido que codifica un compuesto según la reivindicación 1 en los vectores seleccionados del grupo que consiste en pHil­ D8 preparado según el procedimiento descrito en el Ejemplo 19, parte B, pET32a, pGEX-4T.2, UpET-Ubi preparado según el procedimiento descrito en el Ejemplo 20, parte E, y pCYB3. 18. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 16, en la que la célula no es un citoblasto embrionario humano. 19. La célula huésped de la reivindicación 18 en la que dicha célula huésped es una célula eucariota. 46 ES 2 367 307 T3 20. La célula huésped de la reivindicación 19 en la que dicha célula eucariota es Pichia pastoris. 21. La célula huésped de la reivindicación 18 en la que dicha célula huésped es una célula procariota. 5 22. La célula huésped de la reivindicación 21 en la que dicha célula procariota es E. coli. 23. Un procedimiento para preparar un compuesto según la reivindicación 1 que comprende las etapas de: (a) aislar un polinucleótido que codifica dicho compuesto; (b) clonar dicho polinucleótido en un vector de expresión; 10 (c) transformar dicho vector en una célula huésped adecuada; y (d) cultivar dicha célula huésped de manera que exprese dicho compuesto. 47 ES 2 367 307 T3 48 ES 2 367 307 T3 49 ES 2 367 307 T3 ES 2 367 307 T3 51 ES 2 367 307 T3 52 ES 2 367 307 T3 53 ES 2 367 307 T3 54 ES 2 367 307 T3 ES 2 367 307 T3 56 ES 2 367 307 T3 57