Conjugado biológico, que comprende: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada,

y (b) un grupo de unión, presentando dicho conjugado biológico un enlace covalente entre el grupo tiol de SEC ID nº 2 y un grupo funcional en dicho grupo de unión

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un conjugado biológico que comprende proteínas que presentan las secuencias de proteína que codifican una etiqueta que contiene cisteína y un grupo de unión unido covalentemente a la etiqueta que contiene cisteína en la proteína. Asimismo, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los conjugados biológicos en combinación con entidades terapéuticas, diagnósticas, o de investigación seleccionadas.

2. Descripción de la técnica relacionada

La conjugación de proteínas recombinantes con diversas entidades se utiliza en varias áreas. Un área es la administración dirigida de agentes terapéuticos, diagnósticos y de investigación en células diana en el paciente con el fin de mejorar su eficacia y de minimizar los efectos secundarios potencialmente adversos. En este área, los agentes terapéuticos, diagnósticos y de investigación o sus portadores se conjugan químicamente con proteínas recombinantes de direccionamiento que pueden unirse selectivamente a células diana (revisión por Dubowchik y Walker, 1999). Los conjugados resultantes son estructural y funcionalmente heterogéneos debido a que se forman aleatoriamente mediante reacciones químicas con unos cuantos de entre varios grupos químicos disponibles, habitualmente grupos ε-amino de residuos lisina en la proteína de direccionamiento. Debido a que la conjugación aleatoria no discrimina entre residuos aminoácidos funcionalmente importantes y los dispensables en la proteína de direccionamiento, el procedimiento debería desarrollarse ajustado a medida y optimizarse caso por caso con el fin de incrementar la proporción de proteínas funcionalmente activas.

Otro área es la derivatización de superficies artificiales y/o composiciones en masa de dispositivos biomédicos o andamiajes de tejidos con proteínas con diana en determinados componentes del ambiente interno del organismo con el fin de mejorar la compatibilidad superficial con el ambiente y de modular las características deseadas, tales como la afinidad o rechazo de determinados componentes internos del organismo. En este área, las proteínas recombinantes se injertan covalentemente en el material mediante conjugación química aleatoria, habitualmente mediante grupos ε-amino de residuos lisina, que implica residuos aminoácidos tanto funcionalmente importantes como dispensables en las proteínas, resultando en productos heterogéneos con una fracción desconocida de proteínas funcionalmente activas.

Todavía otro área con problemas similares es la construcción de diversos biosensores u otros dispositivos funcionales con superficies derivatizadas con proteínas, que convierten los resultados de las interacciones entre la proteína "activa" y los componentes diana del ambiente en un resultado detectable, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, una señal detectable o los productos de actividad enzimática de proteínas inmovilizadas. En este área, también se conjugan químicamente proteínas recombinantes con superficies artificiales de estos dispositivos, habitualmente mediante grupos ε-amino de residuos lisina, rindiendo superficies heterogéneas con una fracción desconocida de proteínas funcionalmente activas.

Se han desarrollado varios métodos para la conjugación química de proteínas con superficies artificiales (ver, por ejemplo, la patentes US nº 5.492.840 de Malmqvuist, nº 5.853.744 de Mooradian et al., nº

6.033.719 de Keogh, Mann et al., 2001; Kuhl y Griffith-Cima, 1996; Bentz et al., 1998. Estos métodos se desarrollaron caso por caso con el fin de minimizar los daños a la proteína e incrementar la homogeneidad de la superficie.

Estos problemas han sido perfectamente reconocidos, y a lo largo de los años se han desarrollado varios enfoques para introducir en proteínas recombinantes residuos cisteína únicos para la conjugación específica de sitio de diversas entidades. Esta estrategia se basa en la observación de que residuos cisteína intrínsecos en las proteínas habitualmente se encuentran implicados en enlaces disulfuro intramoleculares o entre subunidades y no se encuentran fácilmente disponibles para la conjugación química. En teoría, la introducción de un único residuo cisteína que no afecte a la formación de enlaces disulfuro intrínsecos y que no afecte a la actividad funcional de la proteína recombinante puede proporcionar un grupo tiol disponible para la conjugación específica de sitio mediante enlaces conocidos de la técnica. Por ejemplo, varios grupos han informado de la introducción de cisteínas en fragmentos de anticuerpo Fv de una sola cadena (scFv) recombinantes, habitualmente en los extremos C-terminales o próximamente a ellos, con el fin de utilizar dichos residuos cisteína para la formación de diacuerpos y/o para la conjugación específica de sitio con diversas entidades (Adams et al., 1993; Kipriyanov et al., 1994; Wang et al., 1997; Marti et al., 2001; Gupta et al., 2001; Xu et al., 2002; Li et al., 2002; Renard et al., 2002; Albrecht et al., 2004). Sin embargo, incluso para scFv, la presencia de una cisteína no apareada en el extremo C-terminal o próximamente a ella afecta significativamente al rendimiento, solubilidad y actividad funcional de la proteína (Schmiedl et al., 2000). Futami et al., 2000, introdujeron residuos cisteína en una posición próxima a los extremos N-terminal y C-terminal de la ARNasa I humana, resultando en una ARNasa I estabilidad. Sin embargo, el rendimiento y actividad enzimática del producto se redujeron significativamente. Además, esta ARNasa I mutante o sus fragmentos no fueron utilizados en otros productos.

Otro método para la modificación dirigida a sitio de las proteínas es la ligación mediada por inteína de diversas entidades con el extremo C-terminal de la proteína (ver, por ejemplo, Evans et al., 1999; Tolbert y Wong, 2000; Macmillan et al., 2000; Mukhopadhyay et al., 2001; Hofmann y Muir, 2002; Lovrinovic et al., 2003; Wood et al., 2004). Sin embargo, la aplicación de este método requiere el plegamiento correcto de la proteína fusionada con un domino grande de inteína y la capacidad de resistir condiciones reductoras bastante fuertes durante la ligación mediada por inteína. Además, en ambos enfoques comentados anteriormente, la conjugación con un residuo cisteína disponible se encuentra limitada a entidades que no interfieren con actividades de la proteína a pesar de su estrecha proximidad al cuerpo de la proteína.

De esta manera, en el área de la administración dirigida basada en proteínas de compuestos terapéuticos, diagnósticos y de investigación, así como en el área de la construcción de diversos dispositivos y andamiajes con superficies derivatizadas con proteínas, en la técnica se requieren composiciones y métodos generales que: (1) permitan la conjugación específica de sitio de proteínas recombinantes con diversas entidades con el fin de producir productos más homogéneos de maneras que minimicen la interferencia con actividades funcionales de dichas proteínas, (2) conviertan fácilmente diversas proteínas recombinantes de interés en un formato adecuado para la conjugación específica de sitio, (3) puedan utilizarse con una amplia diversidad de entidades con las que resulta necesario conjugar la proteína recombinante de interés, y (4) no resulten en problemas inmunogénicos o de toxicidad al introducirlos en seres humanos. Se cree que la presente invención es una respuesta a dichos objetivos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado biológico, comprendiendo: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y (b) un grupo de unión, presentando el conjugado biológico un enlace covalente entre el grupo tiol de SEC ID nº 2 y un grupo funcional en el grupo de unión.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado biológico, que comprende: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y (b) un grupo de unión que comprende una proteína adaptadora unida covalentemente al grupo de direccionamiento, presentando la proteína adaptadora un... [Seguir leyendo]

1. Conjugado biológico, que comprende:

(a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y

(b) un grupo de unión,

presentando dicho conjugado biológico un enlace covalente entre el grupo tiol de SEC ID nº 2 y un grupo funcional en dicho grupo de unión.

2. Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende VEGF humano, o una forma mutada o truncada del mismo.

3. Conjugado biológico según la reivindicación 2, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 6 ó SEC ID nº 8.

4. Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende anexina V humana, o una forma mutada o truncada de la misma.

5. Conjugado biológico según la reivindicación 4, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 10.

6. Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende un fragmento catalíticamente inactivo del factor letal del ántrax, o una forma mutada o truncada del mismo.

7. Conjugado biológico según la reivindicación 6, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 12.

8. Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende scVEGF que presenta la secuencia proteica SEC ID nº 4.

9. Conjugado biológico según la reivindicación 8, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 14.

10. Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicho grupo de unión se selecciona de entre fármacos, radionucleidos quelantes, polietilenglicol, pigmentos, lípidos, liposomas y superficies seleccionadas.

11. Conjugado biológico según la reivindicación 10, en el que dichas superficies seleccionadas se seleccionan de entre la superficie de una nanopartícula o micropartícula, la superficie de un dendrímero, la superficie de un andamiaje de tejidos, la superficie de un dispositivo biomédico y la superficie de un biosensor.

12. Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicho grupo de unión comprende una proteína adaptadora complementaria.

13. Conjugado biológico según la reivindicación 12, en el que dicha proteína adaptadora es la ARNasa I humana mutante que comprende Cys18, o un fragmento de la misma.

14. Conjugado biológico según la reivindicación 13, en el que dicha proteína adaptadora presenta una secuencia polipeptídica seleccionada de entre SEC ID nº 16, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20 y SEC ID nº

22.

15. Composición farmacéutica para administrar selectivamente una entidad seleccionada en una diana en un paciente, que comprende:

(a) un portador farmacéuticamente aceptable, y

(b) el conjugado biológico según la reivindicación 1.