NUEVOS CEBADORES Y SONDAS PARA LA DETECCIÓN DEL PARVOVIRUS B19.

Método para la detección de un ácido nucleico diana que comprende la secuencia de ácidos nucleicos del parvovirus B19 en una muestra,

que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que se sospecha que contiene el ácido nucleico diana, (b) proporcionar una pareja de cebadores que comprende un primer y un segundo cebador, en la que el primer cebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 15 y en la que el segundo cebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 17, (c) amplificar el ácido nucleico diana, (d) detectar el ácido nucleico diana amplificado de la etapa (c)

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere a nuevos cebadores y sondas para la detección del parvovirus B19, así como a kits que contienen los mismos. Asimismo, la invención se refiere a métodos en los que pueden utilizarse los nuevos cebadores y sondas, en particular a métodos homogéneos de reacción en 10 cadena de la polimerasa. Además, la invención se refiere a usos de los nuevos cebadores y sondas.

Antecedentes de la invención

La infección por el parvovirus B19 es una enfermedad infantil común que habitualmente sigue un curso leve en 15 individuos inmunocompetentes, produciendo una erupción característica conocida como eritema infeccioso o enfermedad quinta (Anderson M.J. et al., Lancet 1:1378, 1983). La infección puede verse complicada por artralgia severa o una crisis aplástica transitoria en individuos que sufren de 20 enfermedad hemolítica crónica (J.R. et al., Lancet 1:664-665, 1981). La anemia congénita y la vasculitis también han sido descritas (Cohen B., BMJ 311:1549-1552, 1995). Más recientemente, el virus se ha asociado a hepatitis y a miocarditis (Yoto Y. et al., Lancet 347:868-9, 1996; Enders 25 G. et al., Clin. Infect. Dis. 26:355-358, 1998; Dux S. et al., Dtsch Med. Wochenschr. 127:1584-1588, 2002). Tras la infección materna durante el embarazo, el virus puede ser transmitido al feto, causando hidrops, aborto espontáneo o muerte intrauterina (Enders E: Infections of the fetus and 30 the neonate other than rubella. Topley & Wilson's

Microbiology and Microbial Infections. Editado por Collier L., London, Edward Arnold, 1998, páginas 873 a 915). Aparte de la transmisión por la vía respiratoria, la infección por el parvovirus B19 también puede producirse a través de sangre y productos sanguíneos contaminados (Brown K.E., 5 Baillieres Best Pract.Res.Clin.Haematol. 13:245-259, 2000). Lo último ha sido reconocido por la U.S. Food and Drug Administration, resultando en una propuesta de que el ensayo de ácidos nucleicos (NAT) de parvovirus B19 se considere un ensayo realizado durante el proceso y no el cribado de 10 donantes.

En el campo del diagnóstico molecular, la detección de ácidos nucleicos diana con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desempeña un papel importante. El cribado rutinario de bancos de sangre para la presencia del virus de 15 la inmunodeficiencia humana (VIH) o el virus de la hepatitis B (VHB) o C (VHC) es un ejemplo de la aplicación a gran escala del diagnóstico basado en la PCR. Los sistemas automatizados para el análisis basado en la PCR con frecuencia utiliza la detección en tiempo real de la 20 amplificación de producto durante el procedimiento de la PCR. Resulta crucial para dichos métodos la utilización de oligonucleótidos modificados que portan grupos informadores o marcajes. La detección de productos de amplificación de ADN generados mediante un procedimiento de PCR pueden, por 25 una parte, conseguirse en etapas de trabajo separadas. Éstas pueden implicar la caracterización de fragmentos amplificados con respecto a su movilidad electroforética y/o el análisis de productos de amplificación desnaturalizados

unidos a un soporte sólido utilizando una sonda de hibridación.

Por otra parte, la detección de productos de amplificación del ADN puede realizarse en un sistema de ensayo denominado "homogéneo". Un sistema de ensayo 5 "homogéneo" comprende moléculas informadoras o marcajes que generan una señal mientras se amplifica la secuencia diana. Un ejemplo de un sistema de ensayo "homogéneo" es el sistema TaqMan®, que se ha detallado en las patentes US nº 5.210.015, nº 5.804.375 y nº 5.487.972. Brevemente, el 10 método se basa en una sonda doblemente marcada y la actividad exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa Taq. La sonda es complementaria a la secuencia diana que debe amplificarse mediante el procedimiento de PCR y se localiza entre los dos cebadores de PCR durante cada etapa de ciclo 15 de polimerización. La sonda presenta dos marcajes fluorescentes unidos a la misma. Uno es un pigmento informador, tal como 6-carboxifluoresceína (FAM), el espectro de emisión de la cual se encuentra inhibido mediante transferencia energética debido a la proximidad 20 especial de un segundo pigmento fluorescente, 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA). Durante el curso de cada ciclo de amplificación, la ADN polimerasa Taq durante el procedimiento de alargamiento de una cadena de ADN cebada desplaza y degrada la sonda apareada, debiéndose esto último 25 a la actividad exonucleasa 5' a 3' intrínseca de la polimerasa. El mecanismo también libera la sonda apareada de la actividad inhibidora de TAMRA. En consecuencia, la actividad fluorescente se incrementa a medida que se incrementa el corte de la sonda, lo que es proporcional a la 30

cantidad de producto de PCR formado. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la secuencia diana amplificada se mide mediante la detección de la intensidad de marcaje fluorescente liberado. Otro ejemplo de sistemas de ensayo "homogéneos" se proporciona en los formatos utilizados en 5 el instrumento LightCycler® (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.174.670), algunos de ellos denominados en ocasiones formatos de "sonda kissing". Nuevamente, el principio se basa en dos pigmentos interactuantes que, sin embargo, se caracterizan porque la longitud de onda de emisión de un 10 pigmento donante excita un pigmento aceptor mediante transferencia energética por resonancia fluorescente. Recientemente se ha introducido el instrumento AmpliPrep COBAS® (Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemania) para expandir la automatización mediante el aislamiento de 15 secuencias diana utilizando sondas de captura biotiniladas específicas de secuencia conjuntamente con partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Jungkind D., J. Clin. Virol. 20:1-6, 2001; Stelzl E. et al., J. Clin. Microbiol. 40:1447-1450, 2002). Recientemente se ha unido 20 una herramienta versátil adicional, el kit de aislamiento de ácidos nucleicos totales (TNAI) (Roche Diagnostics). Este reactivo de uso en laboratorio permite el aislamiento genérico, no específico de secuencia, de todos los ácidos nucleicos presentes en plasma y suero en el instrumento 25 AmpliPrep COBAS® basándose esencialmente en el método desarrollado por Boom R. et al., J. Clin. Microbiol. 28:495-503, 1990.

Los sistemas de ensayo para el parvovirus B19 se dan a conocer en la publicación de patente japonesa no examinada 30

nº 147986/1995, o por Schorling S. et al., J. Mol. Diagn. 6:37-41, 2004. Los cebadores para la detección del parvovirus B19 de la región VP1 o VP2 se dan a conocer en la patente US nº 6.274.307. La clonación de VP1 y de VP2 se dan a conocer en la patente JP nº 04088985. Se da a conocer una 5 sonda para el parvovirus RA-1 en la patente EP nº 238 893, y las sondas para el parvovirus B19 en la patente WO nº 01/06019. El gen NS1 y sondas del mismo se dan a conocer en la patente EP nº 783 580. La detección basada en la PCR del parvovirus B19 se describe en la patente RU nº 2146372. Se 10 describe una secuencia de ácidos nucleicos de un eritrovirus específico en la patente WO nº 99/28439. La patente WO nº 03/002753 describe un ensayo diagnóstico del parvovirus B19. La patente WO nº 02/00924 describe la fosfolipasa A2 parvovírica. Se describe un método para determinar grandes 15 cantidades de parvovirus B19 en la patente US nº 6.183.999. El ensayo para detectar parvovirus B19 se da a conocer en la patente WO nº 01/14593. Se dan a conocer constructos de control de ADN en la patente WO nº 02/096925. Se describen partículas de tipo parvovirus en la patente WO nº 91/04330. 20 La patente JP nº 11221099 describe la amplificación por PCR del parvovirus B19. Se da a conocer un método para tratar las infecciones por parvovirus B19 en la patente US nº 6.268.349. Se describen vehículos de administración génica autónomos del parvovirus B19 en la patente US nº 5.585.254 y 25 en las patentes US correspondientes y en la patente WO nº 00/24917.

La secuencia del parvovirus B19 se describe en Shade R.O. et al., J. Virol. 58:921-936, 1986, y el análisis del genoma se describe en Cotmore S.F. et al., J. Virol. 60:548-30

557, 1986, y en Ozawa K. et al., J. Virol. 62:2508-2511, 1988. Se describe un método de detección del parvovirus B19 en Sato K. et al., J. Clin. Microbiol. 38:1241-1243, 2000, Cubie H.A. et al., Mol. Cell Probes 9:59-66, 1995; Jordan J.A. et al., Mol. Diagn. 1:321-328, 1996; Vassias I. et al., 5 J. Virol. Meth. 44:329-338, 1993, y Carriere C. et al., J. Virol. Methods 44:221-234, 1993,...

1. Método para la detección de un ácido nucleico diana que comprende la secuencia de ácidos nucleicos del parvovirus B19 en una muestra, que comprende las etapas 5 de:

(a) proporcionar una muestra que se sospecha que contiene el ácido nucleico diana,

(b) proporcionar una pareja de cebadores que comprende un primer y un segundo cebador, en la que el primer 10 cebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 15 y en la que el segundo cebador consiste de la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 17,

(c) amplificar el ácido nucleico diana,

(d) detectar el ácido nucleico diana amplificado de la 15 etapa (c).

2. Método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente, entre las etapas (c) y (d),

(c1) poner en contacto la muestra con una sonda bajo condiciones para la unión de la sonda al ácido 20 nucleico diana,

y en la que la etapa (d) comprende:

detectar el producto de unión entre el ácido nucleico diana y la sonda a modo de indicación de la presencia del ácido nucleico diana. 25

3. Método según la reivindicación 2, en el que la sonda consiste de por lo menos 12 nucleótidos contiguos de secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 5 o una secuencia complementaria de la misma.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que la sonda porta un marcaje.

5. Método según la reivindicación 4, en el que una sonda adicional que porta un marcaje se pone en contacto con la muestra de la etapa (d), de manera que una pareja de 5 sondas que consiste de una primera y una segunda sonda se pone en contacto con la muestra de la etapa (d).

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha etapa de amplificación c) comprende poner en contacto la muestra con dicha pareja de cebadores para producir un 10 producto de amplificación en el caso de que el ácido nucleico diana se encuentre presente en dicha muestra, en el que dicha etapa de hibridación d) comprende poner en contacto dicha muestra con la pareja de sondas, en el que los miemb4ros de dicha pareja de sondas se 15 hibridan con dicho producto de amplificación a no más de cinco nucleótidos uno de otro, en el que la primera sonda de dicha pareja de sondas se marca con un marcaje fluorescente donante y en el que la segunda sonda de dicha pareja de sondas se marca con un marcaje 20 fluorescente aceptor correspondiente,

y detectar el producto de unión entre el ácido nucleico diana y la pareja de sondas de la etapa e) mediante la detección de la presencia o ausencia de transferencia energética por resonancia fluorescente entre dicho 25 marcaje fluorescente donante de dicha sonda y dicho marcaje fluorescente aceptor de dicha segunda sonda, en el que la presencia de transferencia energética por resonancia fluorescente es indicativa de la presencia del ácido nucleico diana en la muestra, y en el que la 30

ausencia de transferencia energética por resonancia fluorescente es indicativa de la ausencia del ácido nucleico diana en la muestra.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que la sonda porta un primer y un segundo 5 marcajes.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el ácido nucleico diana de la etapa c) se amplifica con una ADN polimerasa dependiente de molde.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, 10 en el que el producto de unión entre el ácido nucleico diana y la sonda de la etapa (e) se detectar a partir de la cantidad del primer o segundo marcaje fluorescente que se libera a partir de la sonda hibridada con el ácido nucleico diana mediante 15 hidrólisis de exonucleasa de la ADN polimerasa dependiente de molde.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que la sonda consiste de por lo menos 12 nucleótidos contiguos de secuencia de ácidos nucleicos 20 SEC ID nº 10 o una secuencia complementaria de la misma.

11. Método según cualquiera de las reivndicaciones 2 a 10, en el que la sonda presenta la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 11 o una secuencia complementaria 25 de la misma.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que el cebador y/o la sonda comprende un nucleótido modificado o un compuesto no nucleótido.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en el que se detectan otros ácidos nucleicos diana en la misma reacción.

14. Método según la reivindicación 13, en el que otros ácidos nucleicos diana comprenden ácido nucleico del 5 virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del Nilo Occidental o el virus de la inmunodeficiencia humana.

15. Pareja de cebadores que comprende un primer y un segundo cebador, en la que la secuencia de ácidos 10 nucleicos del primer cebador es SEC ID nº 15, y en la que la secuencia de ácidos nucleicos del segundo cebador es SEC ID nº 17.

16. Utilización de una pareja de cebadores según la reivindicación 15 en una reacción de hibridación con un 15 ácido nucleico complementario.

17. Kit que comprende una ADN polimerasa dependiente de molde, nucleótidos y una pareja de cebadores según la reivindicación 15.